论文部分内容阅读
背景与目的肺癌的侵袭和转移是肺癌的恶性表型和特征之一，也是导致肺癌患者死亡的主要原因。已有的研究表明，肺癌侵袭转移是一个多阶段、多步骤发生的复杂过程，并受肺癌转移抑制基因和肺癌转移促进基因的双重调控。因此，研究和阐明调控肺癌侵袭和转移的分子机制，具有十分重要的意义。表观遗传学是近年肿瘤分子生物学机制研究的热点。表观遗传学是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传改变的学说，即基因型不变而表型发生改变，并且这种改变在细胞发育和增殖过程中能稳定传递。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分之一，它在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育中起着重要作用，尤其与肿瘤的发生发展密切相关。甲基化在肿瘤发生、发展中的作用，包括抑癌基因的高甲基化和癌基因的低甲基化，是肿瘤领域的研究热点和重点课题。NL9980和L9981是从人大细胞肺癌细胞株WCQH 29801分离出的具有不同转移潜能的人大细胞肺癌细胞系。L9981细胞具有高转移性，nm23-H1在该细胞株中表达缺失；NL9980具有低转移性，nm23-H1表达正常。本研究旨在应用甲基化芯片杂交技术来分析具有相同遗传背景和不同转移潜能的人大细胞肺癌细胞株L9981和NL9980之间基因甲基化的差异，为进一步探讨基因甲基化在肺癌转移中的分子生物学机制奠定基础。材料与方法(1)应用TIANamp Genomic DNA提取试剂盒提取L9981和NL9980细胞株的基因组DNA，并应用超声破碎仪破碎基因组DNA；(2)应用MBD2b对破碎的基因组DNA片段进行免疫共沉淀；(3)应用LM-PCR扩增免疫共沉淀所得DNA片段；(4)应用寡核苷酸直接掺入法将cy3和cy5标记扩增的DNA片段，然后与高通量甲基化芯片进行杂交；(5)应用GENEPIX4000B扫描仪对甲基化基因芯片(SBC human CHIP)进行扫描；(6)应用nimblescan软件分析L9981和NL9980中基因甲基化的差异；(7)将L9981细胞株高甲基化和低甲基化基因上传到NIH-DAVID和MILANO网站进行基因功能聚类分析。结果(1)与NL9980细胞株比较，L9981细胞株有97个基因显示低甲基化，其中25个为已知基因，52个为未知基因；(2)与NL9980细胞株相比，L9981细胞株有420个基因显示高甲基化，其中67个为已知基因，353个为未知基因；(3)在L9981细胞株中伴有低甲基化的25个已知基因中，与转移相关的基因有1个(HYAL1)，与侵袭相关的基因有2个(HYAL1，PXMP2)，与凋亡相关的基因有4个，与细胞周期相关的基因5个；(4)在L9981细胞株的67个已知高甲基化基因中，与凋亡相关的基因有12个，与转移相关的基因有4个，与侵袭相关的基因有3个。结论初步完成对不同转移潜能人大细胞肺癌细胞株NL9980和L9981基因甲基化差异的比较分析，得到617个甲基化差异基因，主要涉及转移、侵袭、凋亡和细胞周期调控，从而为进一步探讨基因甲基化在肺癌转移中的分子生物学机制奠定基础。