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目的：探讨降钙素基因相关肽(CGRP)修饰的Bio-Oss?对大鼠原代成骨细胞增殖活性以及成骨能力的影响。 材料与方法： 1.大鼠原代成骨细胞的分离培养与鉴定：本实验通过胰蛋白酶、胶原酶消化法取SD大鼠乳鼠的颅骨进行原代成骨细胞的培养，观察其形态学特点。通过碱性磷酸酶染色以及矿化结节茜素红染色对成骨细胞特性进行鉴定。 2. CGRP最适作用浓度的筛选：实验设定五个CGRP浓度梯度（10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M），分别作用于成骨细胞，在设定时间点使用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法测定不同浓度CGRP作用下成骨细胞的增殖活性，采用碱性磷酸酶检测试剂盒测定不同浓度CGRP作用下成骨细胞的碱性磷酸酶活性，筛选最适CGRP浓度。 3. CGRP修饰Bio-Oss骨替代材料的制备及表征：用选定浓度CGRP溶液对Bio-Oss进行冻干修饰处理后，电子扫描显微镜观察CGRP修饰组、PBS对照组和空白对照组的Bio-Oss的表面形貌。 4. mimic-CGRP的制备：CGRP为含有37个氨基酸的多肽，其中第2-7个氨基酸形成了二硫键环状结构，这个环状结构是CGRP行使生物学功能所必须的。在实验中，将1-3以及5-7个氨基酸用分子量相近的精氨酸替代，将二硫键形成的环状结构破坏的同时，保留了CGRP的长度，称为mimic-CGRP，作为阴性对照。 5. CGRP和CGRP修饰Bio-Oss骨替代材料对成骨细胞的增殖及分化的影响：此部分实验分为两大组。第一组分为CGRP组，mimic-CGRP组以及空白对照组，目的是验证CGRP对成骨细胞增殖分化的影响。第二组分为CGRP-Bio-Oss?组和Bio-Oss对照组。 1）细胞增殖：取第三代生长良好的细胞以1×104/孔的密度接种于24孔细胞培养板，不同实验组施加相应处理因素。CGRP组加入浓度为10-9M CGRP的培养基；mimic-CGRP组加入浓度为10-9M mimic-CGRP的培养基。CGRP-Bio-Oss?组每个培养孔加入1mg CGRP修饰的Bio-Oss, Bio-Oss?对照组每个培养孔加入1mg Bio-Oss。分别培养1、3、5、7d，使用CCK-8试剂检测成骨细胞的增殖水平。 2）成骨相关基因的表达：将生长良好的第三代成骨细胞以1×105/孔的密度接种于6孔细胞培养板，不同实验组施加相应处理因素。分别培养7、14、21d，使用qRT-PCR法检测各组成骨细胞成骨相关基因碱性磷酸酶，骨钙素，Runx2的 mRNA水平的表达。 3） Western Blot检测成骨相关蛋白表达：将生长良好的第三代成骨细胞1×105个/孔的密度接种于6孔细胞培养板，不同实验组施加相应处理因素。培养14d后提取成骨细胞蛋白，通过Western Blot检测各组成骨细胞碱性磷酸酶，骨钙素，Runx2的表达水平。 6.统计分析：采用SPSS20.0统计软件对数据进行统计分析，采用one-way ANOVA进行分析，方差齐时使用LSD法对各组数据进行多重比较，若经Levene检验，数据不满足方差齐性，则采用Dunnett’s T3检验进行两两比较，检验水准为0.05。 结果： 1.大鼠原代成骨细胞的分离培养与鉴定：通过酶消化法可以获得生长状态稳定良好的成骨细胞。原代成骨细胞细胞呈多边形，鳞片状，多突起，包浆丰富，多伪足。碱性磷酸酶染色为阳性。成骨诱导培养后可见矿化结节形成，符合成骨细胞的生物学特性。 2. CGRP最适作用浓度的筛选：CGRP作用浓度为10-9M时，成骨细胞的增殖活性及碱性磷酸酶活性最强。 3. CGRP修饰Bio-Oss骨替代材料的表征电子扫描显微镜观察CGRP修饰组、PBS对照组和空白对照组的Bio-Oss的表面形貌，发现经过冷冻干燥处理，Bio-Oss的表面形貌未见明显改变。 4. CGRP和CGRP修饰Bio-Oss骨替代材料对成骨细胞的增殖及分化的影响 1）细胞增殖：CGRP与mimic-CGRP对照组及空白对照相比有更强的增殖能力。CGRP-Bio-Oss组与Bio-Oss?组相比，有更高的增殖活性。 2）成骨相关基因的表达：CGRP可以增强成骨细胞成骨相关基因的表达。其中ALP的表达在7天时表达量最高，后逐渐下降。OC基因的表达仅在14天时较mimic-CGRP对照组及空白对照组相比有显著升高。Runx2作为早期成骨标志因子，在7天时表达量最高，然后逐渐下降。CGRP在7天和14天使可以显著增强成骨细胞Runx2基因的表达，但在第21天没有作用。经过CGRP修饰的Bio-Oss?与对照组相比能够增强成骨细胞成骨相关基因的表达。CGRP-Bio-Oss?在三个时间点ALP、OC的表达量均高于对照组。Runx2仅在第7天时与对照组相比表达量有显著升高。 3) Western Blot检测成骨相关蛋白表达：结果显示在第14天时，CGRP-Bio-Oss组的ALP, OC, Runx2三种蛋白表达量均高于Bio-Oss组，这与实时荧光定量PCR的结果相一致。 结论： 1.通过酶消化培养法可成功获得原代成骨细胞。 2. CGRP浓度为10-9 M时，成骨细胞的增殖活性及碱性磷酸酶活性最强。 3. CGRP作用下，成骨细胞的增殖活性升高。Bio-Oss经CGRP修饰后与成骨细胞共培养，与Bio-Oss对照组相比，成骨细胞的增殖活性升高。 4.在CGRP作用下，成骨细胞成骨相关基因ALP，OC，Runx2都有提高。使用冻干方法对Bio-Oss进行CGRP修饰后与成骨细胞共培养，与对照组相比，成骨相关基因的表达量也有升高。 5.使用CGRP对Bio-Oss修饰后，可以上调成骨相关蛋白ALP，OC，Runx2的表达。