猪伪狂犬病毒(Pesudorabiesvirus,PRV)属于癌疹病毒科疮疹病毒属,病毒颗粒呈球形,病毒包含囊膜,其直径在150-180 nm。PRV可引起多种家畜感染死亡,猪是最主要的储存宿主和传染源。PRV可引起猪伪狂犬病,其具有较强传染性,会对我国养猪业的健康发展产生重大威胁。发病猪的临床症状主要包括妊娠母猪流产、产死胎和木乃伊胎等繁殖障碍;成年猪主要表现为呼吸系统疾病;仔猪主要表现为神经症状和运动失调,新生仔猪感染PRV死亡率较高,最高可达100%。2011年以来我国多个省份猪伪狂犬发病情况加重,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。为进一步了解PRV的遗传变异和流行病学,本研究从江苏某疑似伪狂犬病发病猪场肺组织中分离到一株PRV野毒株,扩增其gB基因进行遗传进化分析和抗原性分析。然后根据gB基因建立了实时荧光定量PCR方法应用于病料检测,并建立实时荧光定量PCR检测的病毒拷贝数与病毒滴度之间的关系。试验1、猪伪狂犬病毒NJ-guoyao株的分离及其gB基因遗传进化和抗原性分析本研究从江苏某猪场送检仔猪组织中分离获得一株猪伪狂犬病毒,命名为NJ-guoyao株。组织液上清接种BHK-21细胞后出现典型的伪狂犬病变,利用PCR鉴定为PRV后,并对扩增出PRVgB基因片段进行测序。通过与以往发表的伪狂犬病毒gB基因序列比对及进化树分析,显示分离株属于经典毒株,与经典毒株Kaplan、Becker、和NIA3之间的同源性相对较高,在99%以上。gB蛋白抗原性分析显示255-276(22)氨基酸可能为跨膜区,该蛋白存在5个潜在糖基化位点,分别位于第37、147、294、341和365位置,其中294位氨基酸糖基化可能性最高。蛋白中10-30、320-340和350-367这些肽段可能位于蛋白的表面,可能是抗原抗体反应的主要部位。猪伪狂犬病毒NJ-guoyao株的分离为猪伪狂犬疫苗和诊断方法研究提供了材料。试验2、猪伪狂犬病毒gB基因荧光定量PCR检测方法的建立与应用为建立猪伪狂犬病毒gB基因荧光定量PCR检测方法,根据已扩增的gB基因序列设计荧光定量PCR引物。将含gB基因的质粒作为标准品进行10倍倍比稀释,进行荧光定量PCR绘制标准曲线,建立检测方法。该检测方法重复性好,特异性强,与PCV2、PPV、CSFV、JEV和PRRSV不发生反应。该方法最低检出拷贝数为1×103拷贝/μL,而常规PCR反应最低检出浓度为1×105拷贝/μL。采用该方法对20份病料进行检测,与常规PCR相比可提高检出率。猪伪狂犬病毒gB基因荧光定量PCR检测方法的建立,为伪狂犬病毒的鉴别诊断和定量分析提供了有效方法。试验3、荧光定量PCR检测的伪狂犬病毒基因拷贝数与病毒滴度关系为获得伪狂犬病毒基因拷贝数与病毒滴度关系,首先采用细胞病变法测出的病毒滴度。之后应用猪伪狂犬病毒gB基因荧光定量PCR对不同滴度病毒液的基因拷贝数进行检测。不同稀释度的病毒滴度和病毒拷贝数的关系经回归分析,获得线性回归方程为:y = 0.978x +4.216,y = lg(copies/mL),x= lg(TCID50/mL),相关系数为 R2 = 0.9993,说明两者有较好的相关性。PRV-gB基因荧光定量PCR检测PRV病毒滴度成为可能。