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Micro-RNAs作为一类非编码RNA,通过诱导信使RNA(mRNA)的切割或蛋白质翻译的抑制来调节基因的表达,从而参与机体的各个生物学过程。近年来,越来越多的文献也显示了肥胖个体中microRNA表达相对于正常个体的改变,这些变化似乎有助于帮助我们了解该患者群体中代谢紊乱表现的内在因素。家畜养殖过程中,同样也经常出现过度肥育的表现,一方面对家畜繁育有影响,降低遗传育种的速度;另一方面也影响了肉用家畜的屠宰价值,进而降低其经济价值。研究发现,miRNA作为基因转录后水平调控者,在脂肪细胞分化过程中起着重要的调控作用。研究发现miR-10a-5p在各组织中均有表达,但是在脂肪组织中表达量最低,并且miR-10a-5p在人、小鼠、大鼠和猪等不同物种间序列有着高度的保守性。根据测序结果,在猪的背最长肌和半键肌肌内脂肪测序中筛选到差异表达的miR-10a-5p,其表达量在背最长肌肌内脂肪中极显著高于半键肌(P<0.01),并且已有研究报道,背最长肌中前体脂肪细胞含量要明显高于半键肌,本研究预测miR-10a-5p与前体脂肪细胞成脂分化之间存在调控关系。基于此,以C57小鼠作为实验动物模型来探索miR-10a-5p在前体脂肪细胞增殖和分化过程中发挥的生物学功能以及其中潜在的作用机制。通过分离前体脂肪细胞进行体外培养,分别在增殖期和分化期对体外培养的前体脂肪细胞进行转染miR-10a-5p agomir等多种方法探索miR-10a-5p对前体脂肪细胞增殖和分化的影响。接着,分别构建增殖期靶基因Map2k6 3’UTR和分化期靶基因Fasn 3’UTR双荧光素酶报告载体,来验证它们与miR-10a-5p的直接靶定关系。上述研究获得以下主要结果:1.miR-10a-5p促进小鼠前体脂肪细胞的增殖在前体脂肪细胞中过表达miR-10a-5p促进前体脂肪细胞增殖,促增殖相关基因Cyclin D(P<0.01)、PCNA(P<0.05)mRNA水平显著上升,Cyclin E、Cyclin B也有一定程度的上升;而抑增殖相关基因p27、p21的mRNA表达水平均显著性下降(P<0.05)。在蛋白质水平,促增殖相关基因Cyclin D、Cyclin B及PCNA的蛋白表达量均显著升高,而抑增殖相关基因p27、p21的蛋白表达量均显著性下降(P<0.05);流式细胞检测分析显示细胞更多的向分裂间期S期转化,进行DNA分子复制的能力增强,同时EdU染色及CCK8结果也进一步证明了miR-10a-5p在前体脂肪细胞增殖期发挥的促进作用。2.miR-10a-5p在增殖期靶定Map2k6多个靶基因在线软件预测Map2k6作为miR-10a-5p的候选靶基因,并且Map2k6在增殖期的时序表达情况与miR-10a-5p呈相反的趋势,构建Map2k6 3’UTR双荧光素酶报告载体,通过酶活测定,确定Map2k6是miR-10a-5p的靶基因。3.miR-10a-5p抑制小鼠前体脂肪细胞的分化过表达miR-10a-5p后,前体脂肪细胞中成脂分化的标志基因PPARγ、aP2的mRNA的表达水平都显著下调(P<0.05),在蛋白质水平,PPARγ、aP2和adipoQ蛋白的表达量显著下降,成脂关键信号通路p-AKT也显著下降,并且油红O染色及其定量显示转染miR-10a-5p显著的降低了分化期脂滴的积累。说明过表达miR-10a-5p能够抑制前体脂肪细胞的分化。4.miR-10a-5p在分化期靶定Fasn根据软件预测并结合抑分化的表型,将Fasn作为miR-10a-5p调控脂肪分化期的候选靶基因,发现Fasn在分化的时序表达情况与miR-10a-5p呈相反的趋势。接着,构建Fasn 3’UTR双荧光素酶报告载体,通过酶活测定,确定Fasn是miR-10a-5p的靶基因。综合以上,本研究发现miR-10a-5p在脂肪中低表达,体外培养中,过表达miR-10a-5p后显著促进了前体脂肪细胞的增殖,并显著抑制了前体脂肪细胞的分化。表明miR-10a-5p参与调控脂肪生成,不仅丰富了miRNA的研究网络,也为进一步研究家畜脂肪沉积性状形成的分子机理提供了理论依据。