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目的: 反复发作和耐药菌株增多是尿路感染(Urinary tract infection,UTI)防治面临的重点和难点,尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escheriehia.coli,UPEC)侵袭膀胱上皮细胞(Bladder Epithelial Cells,BECs)成为细胞内寄生菌是导致UTI反复发作的主要因素之一。 TLR4/cAMP信号传导通路是介导BECs抗UPEC,清除胞内UPEC以及介导细胞因子IL-6、IL-8分泌的关键通路。 本课题在前期研究的基础上通过体内尿路感染动物模型和体外细胞感染模型,运用微生物学、细胞学和分子生物学技术,研究治疗尿路感染的有效方剂尿感方对TLR4/cAMP信号传导通路主要环节的影响,剖析尿感方抗UPEC的部分作用机制,丰富尿感方治疗UTI作用的现代医学内涵。 方法: 1.通过体内动物模型(UPEC感染小鼠模型)和体外细胞模型(HTB-9 UPEC感染模型,BECs UPEC感染模型),研究尿感方(大鼠含药尿液、人含药尿液和原药)抗UPEC侵袭作用和清除胞内UPEC作用。 2.通过体外细胞模型(HTB-9 UPEC感染模型,BECs UPEC感染模型),采用分子生物学技术研究尿感方(大鼠含药尿液、人含药尿液和原药)对TLR4/cAMP信号传导通路主要环节的影响。 3.通过体外细胞模型(HTB-9 UPEC感染模型,BECs UPEC感染模型),研究尿感方(大鼠含药尿液、人含药尿液和原药)对IL-6、IL-8分泌的影响。 4.通过HTB-9和BECs,研究尿感方(大鼠含药尿液、人含药尿液和原药)对天然免疫受体(TLR4)的作用。 结果: 1.①尿感方体内抗UPEC侵袭作用:与模型组相比,尿感方高剂量组、蒲公英高剂量组和马齿苋高剂量组侵入小鼠膀胱上皮细胞内的活菌数明显减少。 ②尿感方体外抗UPEC侵袭作用:HTB-9和BECs经各药物组预处理后,与模型组和空白尿液组比较,尿感方大鼠含药尿液组、健康人含药尿液组、原药组侵入胞内活菌数明显减少。 ③尿感方抗UPEC侵袭作用机制:与模型组和空白尿液组比较,尿感方含药尿液和原药,蒲公英健康人含药尿液、蒲公英原药与马齿苋原药均能增加TLR4、AC3的基因和蛋白表达;与模型组和空白尿液组比较,尿感方、蒲公英、马齿苋含药尿液均能抑制Rac-1的活性。与模型组和空白尿液组比较,尿感方大鼠含药尿液、健康人含药尿液和原药,蒲公英和马齿苋单味药的大鼠含药尿液、健康人含药尿液和原药均能增加胞内cAMP的含量,促进PKA活化。 2①尿感方体内清除胞内UPEC作用:与模型组相比,尿感方高剂量组胞吐率明显增加。 ②尿感方体外清除胞内UPEC的作用:HTB-9和BECs经各药物组预处理后,与模型组和空白尿液组比较,尿感方大鼠含药尿液组、健康人含药尿液组、原药组的胞吐率明显增加。 ③尿感方清除胞内UPEC作用机制:与模型组和空白尿液组比较,尿感方大鼠、健康人含药尿液和原药均能增加TLR4、AC3、rab27b、caveolin-1、MyRIP的基因和蛋白表达;尿感方大鼠含药尿液、健康人含药尿液和原药均能增加胞内cAMP的含量,促进PKA活化。与模型组和空白尿液组比较,马齿苋大鼠含药尿液、蒲公英原药与马齿苋原药可增加TLR4基因和蛋白表达;蒲公英、马齿苋大鼠含药尿液和原药均可增加AC3、rab27b、caveolin-1基因和蛋白表达。 3.尿感方对UPEC感染HTB-9和BECs中IL-6、IL-8分泌的影响:与模型组和空白尿液组比较,感染1h后,尿感方、蒲公英和马齿苋的大鼠、健康人含药尿液和原药均可促进IL-6和IL-8的分泌;感染4h后,尿感方、蒲公英和马齿苋的大鼠、健康人含药尿液和原药均可抑制IL-6和IL-8的分泌。 4.尿感方对天然免疫受体的作用:与阴性组比较,尿感方、蒲公英和马齿苋的大鼠、健康人含药尿液和原药均能增加HTB-9和BECs的TLR4基因和蛋白表达。 结论: 1.尿感方具有一定的抗UPEC侵袭作用、清除胞内UPEC作用和动态调节IL-6和IL-8分泌的作用。 2.尿感方发挥上述药理作用的机制与TLR4/cAMP信号传导通路的环节(增加TLR4、AC3、rab27b、caveo lin-1、MyRIP的基因和蛋白表达,抑制Rac-1活性,增加胞内cAMP的含量,促进PKA活化)有关。 3.尿感方的组成药物蒲公英和马齿苋均具有一定的抗UPEC侵袭、清除胞内UPEC作用,可动态调节IL-6和IL-8分泌,但在对TLR4/cAMP信号传导通路的具体作用环节和程度上与尿感方存在差异。 4.尿感方及其组成药物蒲公英和马齿苋均能增加天然免疫受体TLR4的表达,从而提高固有免疫作用。