论文部分内容阅读
治疗性血管新生,又称心脏的“自我搭桥”,是在原有的毛细血管基础上形成新血管网络结构的过程,对冠心病缺血心肌的血运重建和血液灌流具有重要意义。血管内皮细胞(EC)是缺血性心脏病中血管新生的主要靶细胞,血管新生信号分子启动EC发生增殖,并与细胞外基质(ECM)解离后,穿过血管壁发生迁移,继而逐渐由血管芽发展为三维血管网络体系,因此在缺氧早期促进EC的增殖、迁移及维持其正常功能对新血管的形成十分必要。血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现的最重要的血管生长因子之一,其诱导特异性受体KDR及其下游信号通路激活可涉及调控内皮祖细胞分化,内皮增殖和存活、迁移、发芽,增加EC通透性等多个过程。作为基因调控的分子开关,miR-126是血管内皮特异性微小RNA(miRNA)之一,已被证实是参与心血管疾病及血管新生的重要调控因子,VEGF是miR-126介导血管新生最主要的靶基因。活血益气方是基于活血益气法构建的临床经验方,可显著改善心肌梗死后心肌缺血,促进梗死边缘区心肌组织的血管新生。本研究预期在明确miR-126对血管新生及VEGF/KDR信号通路调控作用的基础上,探讨活血益气方调控miR-126靶向VEGF信号通路介导缺氧人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移从而促进血管新生的分子机制,并通过对其拆方活血方及益气方的研究进一步揭示活血益气方促进血管新生的科学内涵和配伍规律。目的:以HUVEC作为实验模型,探讨miR-126对血管EC增殖及迁移的影响,明确miR-126在血管新生中的调控作用,揭示血管新生转录后水平的上游基因调控机制;阐明miR-126对VEGF/KDR信号通路的“分子开关”作用,揭示miR-126介导血管新生的下游分子机制。在此基础上,探讨活血益气方及其拆方对缺氧HUVEC增殖、凋亡及迁移的调控作用,并进一步揭示miR-126靶向VEGF信号通路在活血益气方促进血管新生过程中的关键作用,进而从miRNA基因调控角度揭示活血益气方促血管新生的作用机制和配伍规律。方法:(1)将HUVEC置于三气培养箱(1%02,5%CO2,94%N2,37℃)中建立缺氧损伤模型,分为缺氧组、活血益气方组、活血方组及益气方组,另设正常对照组置于细胞培养箱(5%CO2,37℃)中常规培养24h后,同步化24h。活血益气方组、活血方组及益气方组给予含10%相应药物血清培养基培养,模型组及正常对照组给予含10%正常对照血清培养基培养,干预24h。采用CCK-8法检测细胞增殖,Transwell小室检测细胞迁移,Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞仪检测细胞凋亡,WST-1法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力,微板法测定丙二醛(MDA)含量及细胞培养上清乳酸脱氢酶(LDH)含量。实时荧光定量PCR法检测细胞miR-126、VEGF、KDR及下游信号通路关键分子 PKC、Ras、Raf-1、MEK、ERK、FAK、p38、MAPKAPK、HSP27 mRNA的表达水平。(2)将 miR-126 mimics(200nM)/miR-126 inhibitor(400nM)转染至 HUVEC 中 48h 建立miR-126过表达/表达受抑HUVEC模型,另设相应的mimics/inhibitor negative control转染组,采用CCK-8法检测各组细胞增殖,Transwell小室检测细胞迁移,实时荧光定量PCR法检测细胞VEGF、KDR、PKC、p38 mRNA表达水平。(3)建立miR-126过表达/表达受抑HUVEC模型,给予活血益气方药物血清干预细胞24h,采用CCK-8法检测细胞增殖,Transwell小室检测细胞迁移,实时荧光定量PCR法检测细胞VEGF、KDR、PKC、p38 mRNA表达水平的变化。结果:(1)与正常对照组比较,缺氧组HUVEC增殖显著减少;与缺氧组比较,活血益气方组、活血方组及益气方组HUVEC增殖均显著增加,差异有统计学意义(P<0.01);活血益气方组HUVEC增殖高于活血方组、益气方组,但未见统计学差异(P>0.05)。(2)与正常对照组比较,缺氧组细胞PKC、Ras、Raf-1 mRNA表达水平均显著下调,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);MEK、ERK mRNA表达水平下调,但未见统计学差异(P>0.05)。与缺氧组比较,活血益气方组、益气方组细胞PKC、Ras、Raf-1 mRNA表达水平显著上调(P<0.05或P<0.01),活血方组细胞Raf-lmRNA表达水平显著上调(P<0.01),差异有统计学意义;活血益气方组、活血方组、益气方组细胞MEK mRNA表达水平上调,活血益气方组ERK mRNA表达水平上调,但差异均无统计学意义(P>0.05)。活血益气方组PKC、Ras mRNA表达水平显著高于活血方组和益气方组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);活血益气方组MEK、ERK mRNA表达水平高于活血方组和益气方组,但未见统计学差异(P>0.05)。(3)与正常对照组比较,缺氧组HUVEC晚期凋亡率及总凋亡率均显著增加,差异有统计学意义(P<0.01);缺氧组早期凋亡率增加,但未见统计学差异(P>0.05)。与缺氧组比较,活血方组、益气方组HUVEC早期凋亡率显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);活血益气方组早期凋亡率减少,但未见统计学差异(P>0.05);活血益气方组、活血方组HUVEC晚期凋亡率及总凋亡率显著减少,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);益气方组晚期凋亡率及总凋亡率减少,但未见统计学差异(P>0.05)。活血益气方组HUVEC晚期凋亡率低于益气方组,但未见统计学差异(P>0.05)。(4)与正常对照组比较,缺氧组SOD活力显著下降,MDA、LDH含量显著增加(P<0.01或P<0.05)。与缺氧组比较,活血益气方组SOD活力显著提高(P<0.01);活血益气方组、益气方组MDA含量显著降低(P<0.01);活血益气方组、活血方组、益气方组LDH含量均显著降低(P<0.01或P<0.05)。活血益气方组SOD活力显著高于活血方组、益气方组(P<0.01);活血益气方组MDA显著低于活血方组、益气方组(P<0.01);活血益气方组LDH含量较活血方组低,差异有统计学意义(P<0.05),较益气方组低,但未见统计学差异(P>0.05)。(5)与正常对照组比较,缺氧组HUVEC迁移数显著减少(P<0.01)。与缺氧组比较,活血益气方组、活血方组及益气方组HUVEC迁移数均显著增加(P<0.01)。活血益气方组HUVEC迁移数显著高于活血方组,差异有统计学意义(P<0.01),也高于益气方组,但未见统计学差异(P>0.05)。(6)与正常对照组比较,缺氧组细胞FAK、p38、MAPKAPK、HSP27mRNA表达水平均显著下调(P<0.01)。与缺氧组比较,活血益气方组、活血方组、益气方组细胞FAK、p38 mRNA表达水平显著上调(P<0.05或P<0.01);活血益气方组、益气方组细胞MAPKAPK mRNA表达水平显著上调,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),活血方组细胞MAPKAPK mRNA表达水平上调,但未见统计学差异(P>0.05)。活血益气方组HSP27 mRNA表达水平显著上调,差异有统计学意义(P<0.05),活血方组、益气方组HSP27 mRNA表达水平上调,但未见统计学差异(P>0.05)。(7)与正常对照组比较,缺氧组细胞VEGF mRNA表达水平显著上调(P<0.05),KDR mRNA表达水平显著下调(P<0.01)。与缺氧组比较,活血益气方组细胞VEGF mRNA表达水平显著上调,差异有统计学意义(P<0.01),活血方组、益气方组细胞VEGF mRNA表达水平增加,但未见统计学差异(P>0.05);活血益气方组、活血方组、益气方组细胞KDR mRNA表达水平上调,但均未见统计学差异(P>0.05)。活血益气方组VEGF mRNA表达水平显著高于活血方组和益气方组(P<0.05)。(8)与正常对照组比较,缺氧组和药物组细胞miR-126均显著下调(P<0.05或P<0.01)。与缺氧组比较,活血益气方组、活血方组细胞miR-126下调,差异有统计学意义(P<0.05);益气方组细胞miR-126有下降趋势,但未见统计学差异(P>0.05)。(9)与 mimics 阴性对照组(mimics NC 组)比较,转染 miR-126 mimics(miR-126 过表达组)细胞增殖、迁移显著下降(P<0.01)。与inhibitor阴性对照组(inhibitor NC组)比较,转染miR-126 inhibitor组(miR-126表达受抑组)细胞增殖、迁移显著上升(P<0.01或P<0.05)。(10)与mimics NC组比较,miR-126 mimics组miR-126 mRNA表达水平显著上调,VEGF、KDR、PKC mRNA 表达水平均显著下调(P<0.05 或 P<0.01)。与 inhibitor NC 组比较,miR-126 inhibitor 组 miR-126 mRNA 表达水平显著下调,VEGF、KDR、PKC、p38 mRNA表达水平显著上调(P<0.05或P<0.01)。(11)与mimics NC+正常对照血清组比较,转染miR-126 mimics+正常对照血清组细胞增殖、迁移显著下降(P<0.01)。与miR-126 mimics+正常对照血清组比较,miR-126 mimics+活血益气方血清组细胞增殖、迁移显著增加(P<0.01)。(12)与inhibitor NC+正常对照血清组比较,转染miR-126 inhibitor+正常对照血清组 VEGF、KDR、PKC、p38 mRNA表达均显著上调(P<0.05 或P<0.01),与 miR-126 inhibitor+正常对照血清组比较,miR-126 inhibitor+活血益气方血清组VEGF、KDR、PKC、p38 mRNA表达水平显著增加(P<0.05或P<0.01)。结论:(1)活血益气方及其拆方可促进缺氧后HUVEC增殖与迁移,减少HUVEC的凋亡,作用机制可能与其下调内皮细胞miR-126 mRNA表达,上调VEGF、KDR以及其下游PKC-Ras-Raf-1、FAK、p38-MAPKAPK-HSP27信号通路,并减轻细胞氧化损伤,提高抗氧化能力有关,这可能是活血益气方促进治疗性血管新生的作用机制之一。综合分析,活血益气方促增殖和迁移作用优于活血方和益气方,活血方和益气方具有协同配伍的作用。(2)miR-126可显著抑制HUVEC增殖、迁移,对血管新生具有负性调控作用,作用机制可能与miR-126对VEGF、KDR及下游相关信号通路关键分子的抑制作用有关。(3)活血益气方可改善miR-126对HUVEC增殖和迁移的抑制作用,作用机制可能与其减少miR-126对VEGF、KDR、PKC及p38的负性调控有关,提示活血益气方促血管新生的细胞机制与其调控miR-126靶向VEGF信号通路进而促进内皮细胞增殖和迁移有关。