研究目的:先天性免疫系统是机体防御病原体感染的第一道防线,其中RLR-MAVS信号通路是先天性免疫系统抵抗病毒入侵的关键信号通路。RNA病毒感染后,可以激活RLR-MAVS信号通路,从而调控一型干扰素以及促炎症因子的表达,此信号通路的失调或者过度活化将引起多种疾病。因此,探究这一信号通路的精细调控机制具有十分重要的意义。此外,我们还希冀借由RLR-MAVS抗病毒信号通路调节机制的研究,明确一些未在先天性免疫系统中被探究过的蛋白的功能。研究内容:作为一种二甲基精氨酸二甲胺水解酶,DDAH2主要在血管化组织和免疫组织中表达,其在血管化组织中的作用已经被广泛报道,而其在免疫组织中的作用鲜为人知。我们开启了DDAH2在免疫系统中的研究工作,首先,研究其在抗病毒信号通路RLR-MAVS的活化过程中起到的具体调控作用,以及其对于抗病毒反应的调控作用;其次,研究其调控抗病毒信号通路RLR-MAVS活化的具体机制及靶点;最后,以DDAH2作为媒介,研究一氧化氮信号通路和RLR-MAVS抗病毒信号通路之间的相互调节作用。研究方法:1.利用蛋白免疫共沉淀实验分离得到与MAVS具有相互作用的蛋白质;2.利用蛋白质谱方法鉴定与MAVS具有相互作用的蛋白质;3.提取野生型或者Ddah2-/-小鼠的骨髓来源巨噬细胞和胚胎成纤维细胞来确定DDAH2对于RLR-MAVS信号通路的调控作用;4.通过过表达和敲低实验确定DDAH2对于RLR-MAVS信号通路的调控作用;5.通过免疫荧光实验确定DDAH2的亚细胞定位,Drp1磷酸化水平以及定位,线粒体形态;6.通过细胞组分分离实验确定DDAH2的亚细胞定位;7.通过流式细胞术检测一氧化氮的产生;8.通过格里斯实验检测细胞培养基上清中的一氧化氮含量;9.通过半变性琼脂糖凝胶电泳实验检测MAVS聚集体形成情况;10.通过蛋白质磷酸化质谱检测DDAH2被TBK1磷酸化的具体氨基酸残基位点;11.通过构建DDAH2点突变体,探究DDAH2被TBK1磷酸化之后,在促进一氧化氮产生,线粒体移位,调控线粒体形态以及调控RLR-MAVS信号通路活化上的作用。研究结果:1.通过蛋白质免疫共沉淀以及蛋白质谱检测发现DDAH2与MAVS存在相互作用;2.通过DDAH2的过表达和敲降实验检测发现DDAH2负调控RLR-MAVS信号通路的活化,并负调控RLR-MAVS信号通路激活的抗病毒免疫反应;3.通过免疫荧光实验发现DDAH2在RNA病毒感染或RLR-MAVS信号通路激活后会转移到线粒体上,发现在RNA病毒感染后,Drp1磷酸化水平升高并与线粒体共定位,此外,发现RNA病毒感染或RLR-MAVS信号通路激活后,DDAH2的存在会造成线粒体的分裂;4.通过细胞组分分离实验检测发现DDAH2在RNA病毒感染或RLR-MAVS信号通路激活后转移到线粒体上;5.通过流式细胞术发现敲低DDAH2后,RNA病毒感染诱导的一氧化氮的生成量明显降低,也发现过表达DDAH2点突变体之后无法增加病毒诱导的一氧化氮的生成量;6.通过格里斯实验发现DDAH2敲除之后,病毒诱导的一氧化氮的生成量明显降低;7,通过半变性琼脂糖凝胶电泳实验发现DDAH2抑制病毒诱导的MAVS聚集体的产生;8.通过蛋白质磷酸化质谱找到TBK1磷酸化DDAH2的位点;9.通过过表达DDAH2的点突变体,发现DDAH2在被TBK1磷酸化之后无法转位到线粒体上,无法促进一氧化氮的产生以及造成线粒体的分裂,从而无法抑制RLR-MAVS信号通路的活化。研究结论:在RLR-MAVS信号通路激活时,DDAH2转位到线粒体以促进一氧化氮在线粒体微环境中的富集,进而,富集的一氧化氮有效地促进Drp1诱导的线粒体裂变以抑制MAVS聚集体的形成以及下游信号的转导。此外,TBK1可以磷酸化DDAH2,从而抑制DDAH2的转位和一氧化氮的产生。由此确定DDAH2为RLR-MAVS信号通路活化的负调控因子,并揭示DDAH2是RLR-MAVS信号通路与一氧化氮信号通路之间互相调节的重要中介因子。最后,我们的研究还证实了TBK1在一氧化氮信号通路中的新调节功能。