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目的:信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription3,STAT3)在成骨分化中发挥关键作用。然而,STAT3在小鼠前成骨细胞(mouse embryo osteoblast precursor cells,MC3T3-E1)成骨分化中的确切作用仍存在争议,有一部分学者认为STAT3对成骨分化起到正向调节作用,另有部分学者持相反意见。本研究通过评价STAT3抑制剂隐丹参酮(Cryptotanshinone,CPT),STAT3基因沉默及STAT3过表达质粒对成骨细胞增殖、分化及矿化的影响,为制定更有效和可控的成骨细胞分化方案提供基础,并促进其在再生医学中的应用。研究方法:(1)STAT3抑制剂CPT对成骨细胞分化的影响:抑制剂CPT加入第5代MC3T3-E1中实验组,不加抑制剂组为对照组。荧光实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测浓度为10μmol/L的抑制剂CPT组和对照组在成骨分化3、6、9天的STAT3 mRNA表达情况;用CCK8(cell counting kit-8,CCK-8)分析STAT3对成骨细胞增殖活性的影响;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量测定技术分析STAT3对成骨细胞早、晚期分化的影响;培养14、21天后茜素红染色法分析STAT3对成骨细胞矿化的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测抑制剂组和对照组的成骨相关标志蛋白ALP,I型胶原蛋白(collegan I,ColI),骨钙素(OCN,osteocalcin)在成骨细胞分化早、晚期的表达。(2)STAT3基因过表达及沉默对成骨细胞分化的影响:一共分为四组,转染pEX-3-AMP-STAT3、STA3 siRNA为实验组,转染pEX-3-AMP及NC siRNA为对照组;RT-qPCR测定四组细胞转染后在成骨分化期间STAT3 mRNA表达情况;Western blot检测转染6天后四组细胞的ColI,ALP,OCN的蛋白表达情况。结果:(1)RT-qPCR结果显示在3、6、9天三个时间点,10μmol/L CPT组的STAT3 mRNA相对表达量与不加抑制剂的对照组相比较,显著减少(p<0.05);CCK8结果显示抑制剂CPT组与对照组的增殖活性均随着时间呈逐渐上升的趋势,但每个时间点两组的OD值无统计学差异(p>0.05);ALP实验结果表明,在MC3T3-E1成骨分化的第3、6、9天,与对照组相比,抑制剂CPT组ALP活性降低,差异有统计学意义(p<0.05);培养14天后茜素红染色结果显示抑制剂CPT组与对照组均未有矿化结节形成,21天后进行茜素红染色两组均观察到有明显的矿化结节形成,CPT组钙结节生成数量明显少于对照组(p<0.05);Western blot结果显示经过CPT干预3、6、9天后ALP、ColI蛋白相对表达量降低,差异有统计学意义(p<0.05),抑制剂CPT组的OCN蛋白相对表达量在第9天时下降,差异有统计学意义(p<0.05),但在6天时两组的OCN蛋白相对表达量无统计学差异(p>0.05)。(2)RT-qPCR结果显示,与各自阴性对照组相比,STAT3沉默组在成骨分化期间3天、6天均成功下调成骨细胞中STAT3 mRNA,同时pEX-3-AMP-STAT3组显著上调STAT3 mRNA,差异有统计学意义(p<0.05);Western blot结果显示转染6天时pEX-3-AMP-STAT3组的细胞高表达ALP、ColI蛋白而STAT3 siRNA组的ALP,Col I蛋白表达显著下降,差异有统计学意义(p<0.05),但每组OCN的蛋白表达差异无统计学意义(p>0.05)。结论:STAT3对MC3T3-E1成骨分化起到正向调控的作用