微孢子虫是一类专营细胞内寄生，无线粒体的单细胞原生动物。微孢子虫的动物学分布范围非常广，能感染寄生脊椎动物和无脊椎动物，是经济昆虫、鱼类、兔类、皮毛动物、啮齿类及灵长类的致命病原。从1857年Nageli在家蚕中发现家蚕微粒子（Nosemabombycis）后，近二十年来，已相继从家蚕体内分离到微粒子虫属（Nosema）、具褶孢虫属（Pleistophora）、泰罗汉孢虫属（Thelohania）、变形孢虫属（Vairimorpha）和内网虫属（Endoreticulatus）等其它病原性微孢子虫。由于家蚕微粒子能经卵传染危害家蚕子代而被列为蚕种生产的检疫对象，因此对家蚕病原性微孢子虫的病理生物学、分类及鉴定等的研究就显得尤其重要。微孢子虫因被认为是与生物进化有关的最原始的真核生物而倍受关注，由于SSUrRNA普遍存在于真核生物和原核生物的核糖体中，其一级结构种系的保守性表现在所有种系中，比编码蛋白质的基因保守100倍以上，且碱基长度适中，碱基变化的积累以一种类似计时器的方式进行，因此，SSUrRAN在生物进化和系统演化研究中是一个良好的分子指标，已被广泛应用于生物的进化分析和分类，对微孢子虫的SSUrRNA核酸序分析也成为研究的热点。本研究以1997年从蚕体分离到一种次小形微孢子虫SCM₈（SC—四川、M₈—微孢子虫的分类编号）为研究对象，对其病理生物学和分类等进行研究，同时，本研究还对微孢子虫SCM₇（Endoreticulatus bomybicis）的SSUrRNA基因进行克隆和分析，并对微孢子虫门的系统发育和进化进行研究。现将研究结果报告如下： 一、家蚕病原性微孢子虫SCM₈的病理生物学及分类 1、家蚕病原性微孢子虫SCM₈孢子单核，卵圆形，大小介于SCM₇和Nosema bombycis之间，并随继代数的增加而趋小，到第三代时大小稳定，与SCM₇相近，其第一代大小为2.82±0.21×1.89±0.13μm，第三代大小为2.31±0.21×1.25±0.18μm。成熟孢子的孢壁由外壁（EX）、内壁、质膜等三层组成，外壁较薄，表面粗糙。极膜层前部结构致密，后部结构相对疏松。孢子的极丝单列，9～10圈，极丝倾角为：42℃。后极泡圆形，较大。 电镜下的生活史表明，SCM₈的生活史单型，所有时期核不成对，发育周期为9—10天。蚕体内发育的裂殖体生殖呈带状分裂，核大而细胞质较少，以多分裂的方式进行增殖。裂殖体生殖形成的裂殖体近椭圆形，外被寄主细胞的内质网膜（HER）。母孢子原生质团的质膜与HER分离，并以出芽方式进行原生质团的分割，形成多个单核孢子母细胞，在孢子母细胞内可观察到诸如极丝形成等孢子的成熟过程，内质网膜成为多孢孢囊膜。孢囊内有几个至数十个孢子不等，孢囊破裂后可游离出单个孢子。 2、家蚕病原性微孢子虫SCM₈仅感染寄生家蚕的中肠上皮组织，具食下传染，无胚种传染能力，致病力较弱，感染中量(IC₅₀)为：1.29×10⁵，病程12天以上。 3、通过对微孢子虫分类的检索，由于微孢子虫SCM₈无双核，在所有阶段核不成对，符合单倍用纲的特征，应归周于单倍用纲：既M。有前抱子生殖期增殖，抱子卵圆形或梨形，这与伍留目的特点相似，应归用于格留目。 SCN与格留目中的内冈虫回澈抱子虫SCM，（EndNticufot。ho咖ids）有相似之处，二者均寄生家蚕，寄生组织均为中肠上皮组织，界面膜均为寄主细胞的内质网膜，二者的典型发生地均在中国重庆。不同之处为：SCMe ％于的大小发生了变化，抱子成戮不同步，由出芽的先后顾序而定，抱于的极丝田数9l0四；而SCM7的抱子大小未发生变化，原生质团分割时，核与原生质的分界明显，抱子母细胞形成成熟抱子同步，抱子的极丝回技卜－9圈；并且二者的SSUrtu序列的酶切位点也有很大的差异，而SCM与同用的blcettculatus schubeof的ssur删序列的酶切位点完全相同。鉴于此，目前还不能准确确定S皿的科、属．故Spe的分类地位为： 砌1啊 Microsnora CI山．11 H8ploPhasea of．n orforl Glop6ida ISSi，棚6 F－fly Uncertain G巴ifer巴 ＊lC6Yt81R ＾、戳胞于虫 SCM7（Ende～or一 hope）88U删A fN的克回和分析 卜采用Percoll法对三种微抱子虫Nbo帆is、SCMI和SCMS进行纯化，用不同方法分别制备三种微抱子虫的DNA，虽然获得量变化不大，但TEK 法（用KOH＋Tris－HCI＋EDTA＋KCI进行发芽处理）对三种微抱子虫的DNA损伤小，抽提的DNA较完鳖，而常规方法（用NaCO。waAC进行发芽处理）则对小型微抱子虫的洲A损伤较大，容易引起小型徽抱子虫基因组DNA的断裂，对进一步的实验和研究极为不利。因此，TEK法不仅适用于家蚕撇粒子抱子DNA的抽提，而且适合于小型微泡子虫DNA的制备。 2、利用徽抱子虫SSUrMA ＄因共有的保守序列对徽抱子虫SCM7的SSUrRNA核心序列的引物进行了设计，N b删js、SCM和 SCK三种徽抱子虫的 PCR扩槽产物均为一条分子量1200hP左右的特异片段，将经回收的SCM，、SCN的PCR产物用限制性内切酶EcoRy、BcoRI、Xbal、Apall、Smal、Hae