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β地中海贫血是由于β珠蛋白基因HBB突变导致正常β-珠蛋白肽链合成减少或缺失的一种遗传性溶血性贫血,是最常见的单基因遗传病之一,全世界范围内大约有9000万的β地贫携带者,占全球人口1.5%左右。β地贫也是我国南方地区发病率最高、影响最大的致死、致残性血液类遗传病。广东省地贫基因携带率高达16.83%,发病率约7.8%,重症死亡率约3%,据统计,仅广东地区每年重型β地贫患儿的出生数约为4000人,对家庭和社会造成沉重的负担。目前唯一能治愈β地贫的方法为异基因造血干细胞移植,但由于MHC配型率低、预处理毒性及移植物抗宿主病等并发症导致能够从中获益的患者较少。以患者自体造血干细胞为基础的基因治疗成为治愈β地贫的新方案。其中基于慢病毒的基因治疗已经开展了多项临床试验,但由于慢病毒的随机整合特性其临床安全性还需长期随访观察。而由基因编辑技术介导的基因治疗已经成为β地贫治疗研究的热点。利用基因编辑工具通过同源重组修复途径可以对β地贫突变位点进行精确修复,将修复后的自体造血干细胞回输到患者体内有望彻底治愈地贫。CRISPR/Cas9基因编辑技术自2012年发展起来,由于其设计及操作简单、价格低廉很快获得了广泛应用,其核糖核蛋白复合体(ribonucleoprotein complex,RNP)形式由于基因编辑效率高、没有密码子优化和启动子选择的要求、较低的脱靶效应、毒性和免疫反应少,已经成为CRISPR/Cas9的主要应用形式。同源重组修复的体外修复模板主要包括单链寡核苷酸(single-strand oligodeoxynucleotides,ss ODNs)和病毒介导的靶向修饰载体,ss ODNs供体序列一般不超过200nt,主要用于特定突变位点的修复,而我们拟建立一套针对β地贫常见突变位点通用的基因打靶修复方案,因此选择病毒介导的靶向修饰载体作为体外修复模板。其中重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,r AAV)是目前公认最安全的临床级基因治疗载体,且具有4.7kb的供体序列包装能力,其中血清6型对造血干细胞感染效率最高。因此,我们拟联合利用CRISPR/Cas9基因编辑技术的RNP形式及r AAV6体外修复模板建立针对β地贫常见突变位点的通用型基因打靶修复体系,并通过验证该方案的可行性及安全性以期为基因编辑技术介导的β地贫临床治疗奠定理论基础。第一部分利用脐血HSPCs建立通用有效HBB突变位点基因编辑修复体系目的:利用脐血HSPCs建立通用有效HBB突变位点基因编辑修复体系,为后续功能研究及修复疾病来源HSPCs奠定基础。方法:利用CCTop在线设计平台针对HBB基因2号内含子设计5条sg RNA,同时使用Snap Gene软件设计r AAV6体外修复模板;通过载体构建技术构建PX458-sg RNA质粒,T7E1酶切实验及TIDE平台分析sg RNA切割效率;利用电穿孔法转染RNP复合体,同时转导r AAV6,通过优化RNP复合体中cas9蛋白/sg RNA摩尔比、电转参数、r AAV6 MOI值等获得通用有效基因编辑修复体系;利用甲基纤维素单克隆实验及in-out PCR技术验证修复后细胞的基因型及比率。结果:成功建立通用有效HBB突变位点基因编辑修复体系,切割效率可达80-90%,同源重组修复效率平均可达12%;优化的体系参数如下:cas9蛋白/sg RNA摩尔比为1:2.5、电转参数为1600V,10ms,3 p?lse、使用化学修饰sg RNA、r AAV6 MOI值为10~4;基因打靶后的脐血HSPCs中61%为单等位基因修复,35%为双等位基因修复。结论:我们通过优化各种转导参数成功建立了通用有效HBB突变位点基因编辑修复体系,可用于后续功能及疾病来源HSPCs修复的研究。第二部分对脐血HSPCs修复后功能及基因组脱靶效应进行验证目的:分析基因打靶后脐血HSPCs的体内外功能及全基因组脱靶效应。方法:通过CFU实验检测打靶后HSPCs的体外多系形成能力,红系定向分化实验检测打靶后HSPCs的红系分化效率,吉姆萨染色实验检测打靶后HSPCs红系定向分化过程中的形态变化,小鼠移植实验分析打靶后HSPCs的体内长期重建能力,全基因组高通量测序分析基因编辑修复体系的脱靶情况。结果:体外CFU实验结果表明打靶前后HSPCs多系祖细胞形成能力无显著差异;体外红系定向分化实验结果表明打靶前后HSPCs红系定向分化效率无显著差异;小鼠移植实验证实打靶后的HSPCs能够成功归巢并分化,体内修复效率约为2%;全基因组高通量测序分析表明未见明显与打靶方案有关的脱靶。结论:我们建立的通用有效HBB突变位点基因编辑修复体系对脐血HSPCs体外功能无明显影响,且不会诱发明显脱靶效应,移植后虽然体内修复效率降低但仍具有长期重建造血能力。说明我们的通用型基因编辑修复体系不会对细胞功能产生明显影响。第三部分利用已建立的修复体系对βCD41-42 HSPCs进行修复及基因表达验证目的:利用前期建立的基因打靶修复体系对βCD41-42纯合突变HSPCs进行基因修复,并分析修复后细胞的体外红系分化能力及HBB基因表达情况。方法:利用Ficoll密度梯度离心法分离胎肝CD34+HSPCs;流式分析检测胎肝CD34+HSPCs的纯度;Sanger测序验证突变位点修复前后的变化;体外红系定向分化实验分析修复前后细胞的红系分化效率,RT-q PCR法检测修复前后细胞HBB m RNA水平的表达量。结果:分离获得的胎肝CD34+HSPCs纯度达96.7%;基因打靶修复体系可成功对βCD41-42突变位点进行修复;修复后的HSPCs红系分化效率更高;修复后HSPCs的HBB m RNA表达水平是修复前的6倍。结论:我们建立的通用有效HBB突变位点基因编辑修复体系可成功修复βCD41-42位点,修复后的HSPCs具有更好的体外红系分化潜能,且HBB基因m RNA表达水平明显升高。说明我们的通用型基因编辑修复体系具有临床应用潜力。