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背景和目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,严重威胁女性健康,且其发病率呈逐年上升趋势。三阴性乳腺癌是乳腺癌中的预后较差的一种亚型,由于不表达雌激素受体,孕激素受体与人生长因子受体2,因此,在治疗上,不能给予内分泌治疗和靶向治疗,目前,对三阴性乳腺癌的生物学行为特点和探寻新的药物治疗三阴性乳腺癌成为研究的热点。目前的研究结果认为,肿瘤干细胞是肿瘤发生的―种子细胞‖,具有比普通肿瘤细胞更强的放化疗及内分泌治疗抵抗能力,是肿瘤转移灶形成的主要原因。也是导致临床治疗后复发及影响患者无病生存率和总生存率的重要因素。由于乳腺癌干细胞具有多重耐药、易转移等生物学特性,在其治疗上往往缺乏有效的手段,因此,探寻能够抑制或者杀伤三阴性乳腺癌干细胞的药物成为研究重点。多糖,一种来源于植物或者菌类的提取物,具有增强免疫和杀伤肿瘤干细胞的作用。槐耳多糖是一种药用真菌,用于临床治疗具有悠久历史,目前主要用于对肿瘤的治疗,其主要活性成分为蛋白多糖,即6种单糖（L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-木糖、D-葡萄糖和D-半乳糖）组成的杂多糖结合18种氨基酸构成的蛋白质。大量的临床和基础研究证实,槐耳多糖可以通过抑制肿瘤增殖,促进其凋亡发挥抗肿瘤作用,如在肝癌、肺癌、卵巢癌和乳腺癌等。还有研究报道,槐耳多糖能够抑制肿瘤干细胞。虽然目前关于槐耳多糖对三阴性乳腺癌的治疗作用已有初步临床和实验研究,但关于槐耳多糖三阴性乳腺癌细胞干性特征是否具有抑制作用以及其作用的机制尚不清楚。因此,本研究初步阐明槐耳多糖对三阴性乳腺癌干性特征的抑制作用及其机制,可以为槐耳多糖治疗三阴性乳腺癌提供理论基础和实验依据。针对上述问题,本研究主要以三阴性乳腺癌Mb436和为细胞模型,以槐耳多糖为原料进行初步探讨。首先纯化提取槐耳多糖,然后利用CCK-8检测槐耳多糖对三阴性乳腺癌的增殖抑制作用,确定其IC50值;为了验证槐耳多糖是否对三阴性乳腺癌细胞的干性特征具有抑制作用,我们将不同浓度的槐耳多糖加入细胞中,通过成球实验比较给药前后成球能力变化;利用流式细胞仪检测给药前后,ALDH1hing比例的变化;以及通过RT-PCR实验检测Nanog、Oct4、Bmi1等干性相关基因在给药前后的表达变化,初步阐明槐耳多糖对三阴性乳腺癌细胞的干性特征具有明显抑制作用。为明确其作用机制,我们进行了一下研究。乳腺癌是受体依赖型肿瘤,雌激素受体在乳腺癌发生、发展中发挥了重要作用,结合文献报道和我们实验组前期实验发现,雌激素受体α-36（ERα-36）是雌激素受体α（ERα-66,通常描述的ER）最新的一个亚型,在促进乳腺癌细胞增殖,维持乳腺癌干细胞的干性特征等方面具有重要作用。我们首先利用RT-PCR和western blot检测了乳腺癌、、MCF7和Mb231细胞中ERα-36表达情况;并比较了过表达ERα-36后,乳腺癌MCF7细胞的成球、ALDH1hing比例和干性相关基因等变化,明确ERα-36在乳腺癌细胞中维持干性的作用;同时再以三阴性乳腺癌（ERα-66阴性）Mb436为细胞模型,敲低ERα-36的表达,筛选稳转的Mb436/sh36细胞;然后再用不同浓度的槐耳多糖处理Mb436和Mb436/sh36细胞,比较对其成球、ALDH1hing比例和干性相关基因等变化,利用western blot检测ERα-36介导激活的Akt/β-catenin/Cyclin D1通路变化;最后以NOD/SCID鼠为动物模型,将Mb436和Mb436/sh36细胞接种小鼠皮下脂肪垫,分为对照组（未给药组）和给药组（槐耳多糖灌胃处理组）,并比较各组成瘤情况;待安乐处死小鼠后,将移植瘤行免疫组化检测ERα-36和ALDH1的表达变化。通过上述实验,初步明确槐耳多糖能够抑制三阴性乳腺癌细胞的干性特征及其作用的相关机制,为后期临床治疗研究提供基础实验依据。研究方法和主要结果1.槐耳多糖的分离以及对三阴性乳腺癌细胞抑制作用的研究方法将槐耳清膏洗涤、透析后冻干,收集到粗多糖;然后在用DEAE-52离子交换柱洗脱,收集0.1—0.3 Mol/L的洗脱液,得到纯化多糖。再用CCK-8试剂盒检测其对三阴性乳腺癌Mb436和SUM159的抑制作用,检测其48小时的IC50值。结果槐耳多糖有效成分主要在洗脱液的0.1—0.3 Mol/L。因此,收集0.1—0.3 Mol/L的洗脱液中的多糖,共208.54mg,占总清膏的比例:4.17%;槐耳多糖对和SUM159细胞的抑制作用随着其剂量以及作用时间延长,逐渐增大,提示槐耳多糖是槐耳重要的抗肿瘤成分,其对细胞和细胞48小时的IC50值分别为205.12±36.41μg/ml和195.34±27.62μg/ml。提示治疗剂量的槐耳多糖具有抗肿瘤效果,且槐耳多糖的48小时的IC50值浓度远低于槐耳清膏浓度（文献报道多为8-10mg/ml）。2.槐耳多糖对三阴性乳腺癌细胞干性特征抑制作用的研究方法以不同浓度的槐耳多糖分别处理三阴性乳腺癌Mb436和SUM159细胞,观察对其成球的影响;再将槐耳多糖处理的以上细胞,再次行成球实验,观察槐耳多糖对三阴性乳腺癌和细胞第二代、第三代成球影响。流式细胞仪检测槐耳多糖处理后,和细胞中ALDH1阳性细胞的比例变化;以及利用RT-PCR和western blot检测槐耳多糖处理后,和细胞干性相关基因Nanog、Oct4、Bmi1的表达变化。结果槐耳多糖抑制三阴性乳腺癌和细胞的成球能力,还能影响其第二代、第三代的成球率;降低和细胞中ALDH1阳性细胞的比例,以及下调三阴性乳腺癌和细胞中干性相关基因Nanog、Oct4、Bmi1的表达。3.槐耳多糖对三阴性乳腺癌细胞干性特征抑制作用的机制研究方法利用RT-PCR和western blot检测乳腺癌、、Mb231和MCF7中ERα-36的表达水平;利用质粒转染技术构建并筛选过表达ERα-36的MCF7细胞（MCF7/sh36）,以及敲低ERα-36的细胞（Mb436/sh36）;通过成球实验、流式细胞仪检测ALDH1阳性细胞的比例,以及RT-PCR检测干性相关基因的表达情况比较MCF7和MCF7/sh36细胞,以及Mb436和Mb436/sh36细胞的差异。以不同浓度的槐耳多糖处理Mb436和Mb436/sh36细胞后,观察对两株细胞在成球能力、ALDH1阳性细胞的比例以及干性相关基因的变化情况,同时利用western blot检测比较ERα-36、p-AKT、β-catenin和cyclin D1蛋白表达水平变化。在体内实验中,比较槐耳多糖给药前后,Mb436和Mb436/sh36细胞在NOD/SCID鼠中成瘤能力的变化情况。结果3.1.ERα-36高表达于三阴性乳腺癌（ERα-66,通常描述的ER）Mb436、SUM159和Mb231细胞中,较低表达于MCF7（Lumina型）细胞;过表达ERα-36能够促进MCF7细胞成球能力、上调ALDH1阳性细胞的比例以及高表达干性相关基因,敲低ERα-36后结果则反之。3.2.槐耳多糖能够抑制三阴性乳腺癌Mb436细胞的成球能力、降低ALDH1阳性细胞的比例,下调干性相关基因的表达和抑制NOD/SCID鼠成瘤体积,但是在敲低ERα-36的Mb436/sh36中,上述结果在对照组和给药组均无明显差异;western blot检测发现,槐耳多糖能够抑制ERα-36、p-AKT、β-catenin和cyclin D1蛋白表达水平,但是槐耳多糖处理Mb436/sh36细胞前后比较发现,上述蛋白水平表达变化不明显。结论1、槐耳多糖具有抗肿瘤效果,且槐耳多糖的48小时的IC50值浓度远低于槐耳清膏浓度;2、槐耳多糖能够抑制三阴性乳腺癌细胞干性相关特征;3、ERα-36在维持三阴性乳腺癌（ERα-66阴性的乳腺癌）干性特征中具有重要作用;槐耳多糖抑制三阴性乳腺癌干性特征的作用与ERα-36的表达密切相关,并且是通过ERα-36介导的AKT/β-catenin/cyclin D1信号通路发挥作用的。