【摘 要】
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炎症性肠病（Inflammatory bowel diseases,IBD）包括克罗恩病（Crohn disease,CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）,虽然克罗恩病和溃疡性结肠炎表现出不同的生理病理特征,但都以慢性复发性肠道炎症为主要特征。主要临床表现为反复发作的腹痛、腹泻和黏液脓血便。病程常常迁延不愈,给患者身心造成了极大的痛苦。患者长期的炎症性病变也大大增加了
【基金项目】
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中国国家青年千人计划; 中国国家自然科学基金（No.81871280）
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炎症性肠病（Inflammatory bowel diseases,IBD）包括克罗恩病（Crohn disease,CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）,虽然克罗恩病和溃疡性结肠炎表现出不同的生理病理特征,但都以慢性复发性肠道炎症为主要特征。主要临床表现为反复发作的腹痛、腹泻和黏液脓血便。病程常常迁延不愈,给患者身心造成了极大的痛苦。患者长期的炎症性病变也大大增加了罹患大肠癌及小肠腺癌的风险。目前炎症性肠病还没有特别有效的治疗药物,发病机理至今尚未完全明确,但越来越多的证据表明遗传、环境和免疫因素协同导致了疾病的发生和发展。全基因组关联分析（Genome-wide association studies,GWAS）的研究发现了多个IBD易感性相关的基因,其中多个基因编码的蛋白参与了细胞自噬的调节,包括Autophagy related 16 like 1（Atg16l1）、Unc-51 like autophagy activating kinase 1（ULK1）和Immunity related GTPase M（IRGM）等。这些遗传学证据表明自噬在炎症性肠病的发生发展中发挥着重要的作用。RING finger protein 186（RNF186）基因编码一种含有RING结构域的E3泛素连接酶。之前的GWAS研究发现RNF186编码序列的两个罕见变异（rs41264113和rs36095412）与UC的易感性相关。这两个变异编码的蛋白改变为RNF186A64T和RNF186R179X。其中,RNF186A64T是第64位丙氨酸到苏氨酸酸改变;RNF186R179X是第179位氨基酸提前终止突变。有意思的是,这两种RNF186的变异体导致不同的UC易感性:其中RNF186A64T导致UC的易感性增加;而RNF186R179X是保护性变异,携带该变异的人不易患UC。尽管遗传学的证据提示RNF186与溃疡性结肠炎易感性密切相关,但RNF186在其中发挥的作用以及其变异与UC易感性的分子机制并不清楚。本研究通过分子生物学、细胞生物学手段以及实验动物造模发现RNF186通过泛素化修饰调节了EFNB1-EPHB2信号激活的自噬,该信号激活的自噬在结肠上皮细胞中对于清除胞内细菌以及维持肠道稳态至关重要。另外,本研究还发现注射重组蛋白ephrin-B1-Fc对于DSS诱导的小鼠结肠炎具有一定的治疗作用,提示该重组蛋白具有成为治疗人溃疡性结肠炎药物的潜力。在具体的分子机制研究中,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在结肠上皮细胞中构建敲除RNF186的细胞系,以及分析溃疡性结肠炎病人结肠组织中的蛋白表达,发现RNF186参与维持了结肠上皮细胞的自噬水平。通过相互作用蛋白的质谱鉴定及免疫共沉淀实验发现受体酪氨酸激酶EPHB2和EPHB3是RNF186的泛素化底物,RNF186能够在体内体外泛素化EPHB2和EPHB3。发现UC易感性变体RNF186A64T失去了与EPHB2的相互作用,损伤了EPHB2的泛素化,而UC保护性变体RNF186R179X增强了与EPHB2的相互作用,从而提示RNF186参与调控溃疡性结肠炎的易感性是通过EPHB2实现的;RNF186A64T变体是一个功能丧失的变异,而RNF186R179X是一个功能获得性变异。通过免疫印迹及免疫荧光实验进一步发现EPHB2的配体EFNB1（ephrin-B1）能够作用于结肠上皮细胞诱导自噬,该过程依赖于RNF186和EPHB2。通过质谱鉴定泛素化位点,发现EPHB2第892位赖氨酸（K892）在RNF186的催化下发生泛素化修饰,而且EFNB1-EPHB2诱导的自噬依赖于RNF186介导的EPHB2 K892的泛素化。此外,该位点对于EPHB2和自噬蛋白MAP1LC3B的相互作用非常重要。通过庆大霉素保护实验发现EFNB1-RNF186-EPHB2轴诱导的自噬对于结肠上皮清除胞内细菌感染至关重要,该通路失活导致结肠上皮细胞清除胞内细菌缺陷,提示该机制是RNF186变异导致UC易感性的主要原因;利用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠结肠炎模型发现与对照组小鼠相比,rnf186-/-或ephb2-/-小鼠都产生了更严重的结肠炎表型,验证了这两个分子在小鼠溃疡性结肠炎模型中的重要作用。此外,本研究还发现为小鼠注射ephrin-B1-Fc重组蛋白能激活结肠上皮细胞自噬,并能在一定程度上减轻DSS诱导的小鼠结肠炎症状,而且该过程依赖于EPHB2。总之,该研究在分子、细胞和动物个体水平上解析了RNF186在炎症性肠病中发挥的功能及其作用机制;首次发现了RNF186通过调节EFNB1-EPHB2通路诱导的自噬影响溃疡性结肠炎的发生和发展;并提出重组蛋白ephrin-B1-Fc可以缓解DSS诱导的结肠炎表型,为人溃疡性结肠炎的治疗提供了一种新的思路和手段,具有重要的生理、病理意义。
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