前言 心肌细胞中细胞内钙离子浓度(Intracellular calcium concentration，[Ca²⁺]_i)的变化显著影响着L型钙电流。增高的[Ca²⁺]_i对L型钙通道能够产生两个互为相反的自身反馈性调节。首先[Ca²⁺]_i的升高可通过一个被称为激活的过程来增加L型钙电流；也可引发失活过程导致L型钙电流的下降。钙调蛋白（Calmodulin，CaM）作为一种Ca²⁺敏感感受器在Ca²⁺依赖性的自身调节过程中发挥着重要作用。钙调蛋白激酶Ⅱ（Calmodulin kinaSeⅡ，CaMKⅡ）介导的通道磷酸化过程也可能参与上述作用。本实验应用豚鼠单一心室肌细胞，利用细胞贴附式膜片钳制技术，记录单通道L型钙电流，并应用不同的CaM和CaMKⅡ阻断剂，观察CaM和CaMKⅡ在豚鼠心室肌细胞L型钙通道钙依赖性激活和失活过程中的作用，从分子水平上为明确L型钙通道的调控机制提供了直接的实验依据。 材料与方法 1．单个心室肌细胞制备 健康成年豚鼠（体重400～600g），雌雄不限，苯巴比妥钠(30 mg·kg^-1)腹腔注射麻醉后，在辅助呼吸下进行主动脉插管。取出心脏，用胶原酶分离豚鼠心室肌细胞，将分离的细胞置于4℃冰箱稳定1 h后待用。 2．膜片钳记录和数据分析 应用膜片钳放大器利用细胞贴附式膜片钳制技术进行单通道电流记录。通过钙通道的钡电流由从-70至0 mV的去极脉冲引出，波宽200ms，刺激频率0.5Hz，经由膜片钳放大器记录后以3.3 kHz的采集速率输入计算机，减去漏电流。测定实验脉冲开始后5～105 ms期间的平均电流（I）并除以单通道电流幅值（i）以获得通道开放频率（NP₀），其中N为膜片中的通道数目，P₀为通道的平均时间开放频率。高钙液灌流前在无钙灌流液中稳定记录电流3min，以其均值NP₀作为各细胞基础NP₀。 3．[Ca²⁺]；的测定液中下。将盛放于玻璃平皿内的待测细胞与Fura一2/AM的终浓度为2林M)后，Fula一2/AM在37℃下孵育1h（溶置于连有灌流装置的荧光显微镜室温20℃时细胞在无钙灌流液中以lmF而n速度灌流3而n后，换为高钙灌流液灌流，共观察30min。 用40x物镜观察细胞，在340nm和380nm激发波长下的荧光比值变化（R340乃s0）用Aquacosmos/Rati。荧光记录仪测定。依公式求得〔C扩‘〕;。4.实验结果用均值士标准差表示，数据处理用studentst检验分析。p<0.05为差异显著。实验结果1.L型钙通道钙依赖性的激活和失活应用细胞贴附模式记录单通道钙电流，当封接形成后连续记录电流3min，以确定通道活性的稳定。当由高K十无C矿呼灌流液转为高K‘高CaZ十溶液灌流时，NP。最初增加（钙依赖性激活），14），这种效应转为抑制（钙依赖性失活）。 2.CaM对钙依赖性激活和失活的影响当灌流4.89土1 .27而n后(n二在应用不同浓度的CaM阻断剂ChIO甲omazine场drochioride（CPZ）（1，10，100林M）预处理豚鼠心室肌细胞后，被抑制，并显示出剂量依赖性。同时，与对照组相比，其激活和失活过程均到达NP。最高值的平均时间分别为5 .80士0.83 min，比无统计学差异果与CPZ相似。6 .01土1 .79 min，6.17士2.14min（n==5一9），与对照组相。应用另一种CaM阻断剂Calmidazolium（1林M）后，其结3.CaMKn对钙依赖性激活和失活的影响应用0.1，l，3协M CaMKll特异性阻断剂KN一62预处理豚鼠心室肌细胞后，记录单通道电流方法同前。应用不同浓度KN一62后，钙依赖性激活土应和失活仍然存在，但到达NPO最高值所需时间逐渐延长，分别为6.202.59而n，7 .75土3.肠min，8.60土1.82n云n，显示出剂量依赖性（n二6）。用另一种肤类caMKn阻断剂AIP一m（1;M）后，结果与KN一62相似。4.eaM和eaMKll对[e扩‘]、的影响应用双波长荧光光度法对FUIa一2负载的豚鼠c矿‘〕。测定。[CaZ‘〕;通过下列公式求得:[C扩+]*二心室肌细胞进行了Kdp（R一RJllin）/（Rmax一R）。其中Kd二200nM，计算所得p=10.92，Rmax=4.03，凡‘n二1 .12（n=5）（见实验方法部分）。在对照组中发现，当转为高钙液灌流后，[C扩‘]。缓慢增加，在14.97土0.osmin（n=6）达到峰值。翻一62（1林M）能够减慢【CaZ+〕;的上升，在转为高钙液灌流21 .50士0.30面后到达峰值，与对照组相比具有明显统计学差异（n二5，p<0.01）。而10卜Mc咒能够使计算所得的【CaZ+〕，峰值由对照组的1092 .00土232.60nM增至6404 .43土347 .17nM，二者之间差异非常显著（n=6，p<0.01）。讨论 Ca“‘内流以及它所引发的〔C扩‘〕*升高可诱发L型钙通道钙依赖性激活和失活。当细胞外液K‘浓度为140mM时，细胞膜电位为0，〔C扩+〕‘水平随细胞外eaZ‘浓度（Extraeellular ealeium eoneenti妞tion，[e扩+j。）的变化而改变。本实验在单通道水平上研究了〔caZ‘〕;对心肌细胞L型钙通道的双重调控作用。钙依赖性失活可以缩短动作电位时程，由此对动作电位期间CaZ‘通过钙通道内流的总量进行调控。钙依赖性失活是L型钙通道的一个典型特征，对防止细胞内钙超载具有重要的生理意义，尤其对于大量Ca，十通过L型钙通道进人细胞内时意义?