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第一部分 男性化肾上腺皮质腺瘤1例病例报告及基因差异表达分析目的男性化肾上腺皮质腺瘤是一种临床少见疾病,目前其发病机制尚不清楚。我们通过对男性化肾上腺皮质腺瘤的肿瘤及瘤旁组织进行转录组测序探究其雄激素异常分泌的分子机制。方法对2015年我院1例男性化肾上腺皮质腺瘤女性患者密切随访,完整记录其临床信息,并对其手术后的肿瘤及瘤旁组织进行转录组测序,对测序结果通过生物信息学分析其差异表达基因及差异基因的生物学功能。结果中年女性,因“不孕14年”入院。实验室检测发现血清睾酮（T）、硫酸脱氢表雄酮（DHEA-S）明显升高。影像学检查提示左侧肾上腺占位,卵巢及垂体未见异常。术后病理:肾上腺皮质腺瘤。三年后,出现右下腹疼痛,CT扫描发现右肾上腺结节。实验室检测显示T和生物活性T升高。术后病理提示肾上腺皮质腺瘤伴结节状增生。第一次原发肿瘤测序共有239个基因表达表达上调,862个基因表达下调,其中与激素合成相关的基因CYP1A2,AKR1C1和AKR1C2表达下降,而CTAG2,TEX15,CYP1B1和GNRHR基因表达升高;第二次复发测序结果显示有134个基因表达上调,809个基因表达下调。此外对复发后的组织标本进行全转录组测序显示共有286个lncRNA表达上调,251个lncRNA表达下调;39个cirRNA表达上调,60个cirRNA表达下调;112个miRNA表达上调,153个miRNA表达下调。结论男性化肾上腺皮质腺瘤是一种对女性第二性征发育和生育有严重影响的疾病,测序结果显示未见与雄激素合成相关基因出现差异表达,说明可能有其他基因或转录后调节参与了雄激素合成的调节过程。第二部分 KSR2基因调节男性化肾上腺皮质腺瘤雄激素分泌和增殖作用机制研究目的男性化肾上腺皮质腺瘤患者测序结果显示KSR2基因表达下降,提示KSR2可能与该疾病雄激素异常分泌及增殖相关。此部分研究以NCL-H295R细胞为模型,探究KSR2调节雄激素分泌和增殖作用分子机制,以期为男性化肾上腺皮质腺瘤的诊断治疗找到新的分子靶点。方法通过免疫组化分析无功能肾上腺皮质腺瘤、男性化肾上腺皮质腺瘤、肾上腺醛固酮腺瘤、肾上腺皮质癌中KSR2蛋白表达情况,敲减KSR2慢病毒转染NCL-H295R细胞后,通过ELISA检测DHEA和DHEA-S水平,后再用过表达KSR2慢病毒转染NCL-H295R细胞,ELISA检测DHEA和DHEA-S水平;接着敲减KSR2基因后,RT-PCR检测肾上腺雄激素合成相关基因（SATR、CYP17A1、HSD3B2、SULT2A1、SF-1、DAX-1、AKR1C3、CYP11A1）表达情况,然后通过Western blot检测肾上腺雄激素合成相关蛋白（CYP17A1、HSD3B2）表达水平。下载TCGA数据库肾上腺皮质癌临床数据,分析雄激素分泌与肾上腺肿瘤的相关性;随后通过Celigo和MTT检测细胞的增殖能力,流式细胞检测细胞周期和凋亡情况,平板克隆实验检测细胞克隆能力。结果免疫组化结果显示男性化肾上腺皮质腺瘤中KSR2相较于其他几种肾上腺皮质肿瘤表达降低,在敲减NCL-H295R细胞KSR2基因表达后,ELISA结果显示DHEA和DHEA-S分泌增加,而过表达KSR2基因后DHEA和DHEA-S分泌降低。RT-PCR检测显示,抑制KSR2使肾上腺雄激素合成相关基因CYP17A1、HSD3B2表达升高,Western blot结果也证实抑制KSR2后CYP17A1、HSD3B2蛋白水平升高;反之,过表达KSR2后CYP17A1、HSD3B2蛋白水平下降。对TCGA数据库中肾上腺皮质癌数据分析发现,雄激素与肾上腺皮质癌预后负相关。Celigo检测结果显示抑制KSR2细胞增殖减弱,MTT分析再次证实敲减KSR2能够抑制细胞增殖;在抑制KSR2后细胞凋亡数目明显增加,克隆能力减弱,细胞周期停滞,与细胞周期相关的Cyclin D1和CDK4表达下降,而过表达其增殖能力明显增强。结论KSR2蛋白在男性化肾上腺皮质腺瘤低表达,KSR2与NCL-H295R细胞肾上腺雄激素合成负相关,且过表达KSR2能够抑制肾上腺雄激素合成相关基因CYP17A1、HSD3B2表达。同时,KSR2能够抑制NCL-H295R细胞的凋亡,促进其增殖和克隆能力。第三部分 KSR2基因通过ERK信号通路调节男性化肾上腺皮质腺瘤雄激素分泌和增殖功能的机制研究目的探究KSR2基因通过ERK信号通路调节男性化肾上腺皮质腺瘤雄激素分泌和增殖功能的分子机制。方法通过免疫组化分析无功能肾上腺皮质腺瘤、男性化肾上腺皮质腺瘤、肾上腺醛固酮腺瘤、肾上腺皮质癌中ERK1/2、CYP17A1、HSD3B2蛋白的表达情况。STRING数据库分析KSR2的蛋白互相作用情况,接着分别敲减和过表达NCL-H295R细胞KSR2基因,Western blot检测ERK1/2以及磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表达变化,免疫荧光分析p-ERK1/2在NCL-H295R细胞的定位。用ERK抑制剂U0126处理NCL-H295R细胞,ELISA检测DHEA和DHEA-S浓度的变化情况,Western blot检测ERK1/2、p-ERK1/2、CYP17A1、HSD3B2的表达情况。同时采用蛋白激酶A信号通路激活剂8Br-cAMP处理NCL-H295R细胞,ELISA检测DHEA和DHEA-S浓度的变化情况,Western blot检测 ERK1/2、p-ERK1/2、KSR2、CYP17A1、HSD3B2 的表达情况。U0126处理过表达KSR2的NCL-H295R细胞,MTT检测细胞的增殖能力,流式细胞检测细胞周期和凋亡情况,平板克隆实验检测细胞克隆能力。结果免疫组化结果显示ERK和CYP17A1在男性化肾上腺皮质腺瘤肿瘤组织中表达明显升高,HSD3B2表达未见明显差异。STRING数据库分析显示KSR2主要与MAPK信号通路相互作用密切。在敲减KSR2基因后,ERK蛋白表达未见明显改变,p-ERK1/2表达下降;过表达KSR2基因,p-ERK1/2表达升高,免疫荧光显示敲减KSR2基因后p-ERK1/2细胞核定位减少。而U0126处理后,ELISA结果显示DHEA和DHEA-S分泌增加,Western blot结果显示p-ERK1/2表达下降,CYP17A1、HSD3B2表达升高;而U0126能部分逆转过表达KSR2引起的p-ERK1/2表达升高,CYP17A1、HSD3B2表达下降。8Br-cAMP能够促进DHEA和DHEA-S分泌,抑制ERK1/2磷酸化,而且8Br-cAMP能够抑制KSR2蛋白表达。同时U0126能部分抑制过表达KSR2引起的NCL-H295R细胞增殖能力增强,凋亡减少。结论KSR2基因能够促进NCL-H295R细胞ERK1/2的磷酸化及向细胞核的转运;抑制ERK通路能够促进CYP17A1、HSD3B2表达及雄激素分泌;KSR2可以通过ERK信号通路促进NCL-H295R细胞增殖。