背景黑眼圈很常见,对于各年龄段患者的容貌有不同程度的影响。黑眼圈多被认为与睡眠不足、吸烟和生活压力有关,随着这些因素的减少而症状减轻,尽管这些联系尚未得到证实。人体皮肤中,黑色素在表皮层和真皮层中的分布和含量决定着皮肤的基础颜色,真皮胶原和弹性纤维的含量、比例和排列决定皮肤的厚度、透光性和老化状态。既往研究认为,黑眼圈主要包括以黑色素颗粒相对增多为主的色素型、因皮肤较薄而显露皮下血管及眼轮匝肌的血管型、以及这两种类型的混合型。由于临床缺乏对于黑眼圈皮肤成分的定量分析,黑眼圈诊断分类的标准和严重程度的量化较为模糊,其治疗方法的具体参数也不够明确。对于黑色素、胶原和弹性纤维的定量分析,传统方法均需要活检并应用染料处理标本,有创并且耗时。虽然共聚焦显微镜和Visa-CR等设备的应用在色素分子的成像研究方面取得了一定的成功,但此类方法对于黑色素颗粒缺乏敏感性和特异性。因此,在对黑眼圈皮肤中黑色素颗粒以及胶原和弹性纤维的定量分析中,一种无创、特异、快速且不需要标记的方法是非常有必要的。近年来,随着医工交叉学科的快速发展,多光子显微镜（Multiphoton Microscopy,MPM）作为一种无创无标记的成像工具,代表了生物医学研究的新前沿。目的本研究采用泵浦-探针（pump-probe）技术对下眼睑皮肤组织进行了黑色素颗粒成像,并应用二次谐波（Second Harmonic Generation,SHG）和双光子激发荧光（Two-Photon Excited Fluorescence,TPEF）进行了真皮层胶原纤维和弹性纤维的成像,通过黑眼圈皮肤成分的定量分析和参数统计对黑眼圈进行诊断分类和严重程度的量化分级,以实现黑眼圈精准诊疗的目的。材料和方法1.下眼睑皮肤组织样本的组织学检测与pump-probe成像:将下眼睑成形术中获取的下眼睑皮肤组织样本置于-196℃的液氮中冷冻保存,切成6 μm厚的纵向切片,选择三个相邻的切片,其中一个进行非线性光谱成像,另外两个切片分别进行HE染色和硫酸亚铁（FeSO4）染色。样本采集严格遵守人类临床研究的伦理要求和制度规则,获得所有参与研究的患者的知情同意。采用双输出飞秒激光系统,用波长为850 nm的120-fs激光器作为探针光束,以1045 nm为中心的200-fs激光作为泵浦光束,采用声光调制器在2.8 MHz频率下调制。两束光束通过二向色反射镜共线结合。使用40×的水浸物镜对样品进行聚焦,使用油冷凝器采集样品的激光。用两个滤波器（ET845/55 m、ET795/150 m）滤掉泵浦光束,用光电二极管检测探针光束,用锁相放大器提取探针光束损耗信号。2.Pump-probe图像与FeSO4染色结果的数据分析:制备纯黑色素溶液样品作为黑色素pump-probe成像的参照标准,分别获得标准品以及皮肤切片的瞬态吸收光谱（衰减曲线）并对衰减轨迹进行对比分析,以确证实验样本pump-probe图像中的目标区域为黑色素颗粒。分别计算pump-probe图像和FeSO4染色结果的黑色素含量指数（Melanin Content Index,MCI）及其组内相关系数（Intraclass Correlation Coefficient,ICC）;同时,对MCI值与患者面部影像的L*值进行相关性分析;并分别计算表皮基底层和真皮浅层的MCI均值和黑色素平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity,MFI）的均值。3.下眼睑皮肤组织切片的SHG和TPEF成像:采用皮秒可调谐激光器提供一个激发光束并调谐到波长800nm,重复频率为80-MHz。激发光扩束后,通过扫描振镜系统进行二维光栅扫描。然后使用光学显微镜60×的水浸物镜对样品进行聚焦,并采集样品反射的激光。用两个滤波器（ET395/25 M-2P、ET520/60 M-2P）滤掉入射光束,一个滤波器（ET395/25 M-2P）用来SHG成像,另外一个滤波器（ET520/60 M-2P）用来TPEF成像。利用光电倍增管模块（PMT）对信号光束进行电子发射检测,并记录数据。4.SHG与TPEF图像的数据采集与统计分析:将SHG与TPEF图像导入Image J软件中,计算下眼睑皮肤的真皮老化指数（Second Harmonic to Autofluorescence Aging Index of Dermis,SAAID）;SHG 图像进行快速傅里叶变换（Fast Fourier Translation,FFT）后计算胶原纤维束的排列方向指数（the Orientation Index of Collagen Bundles,OICB）;随机选择5个同等大小的视野并分别计算SAAID值和OICB值的平均值。最后,对于不同类型黑眼圈皮肤和正常皮肤、以及不同年龄阶段的SAAID值和OICB值进行统计分析,评估真皮层随年龄的变化以及不同类型皮肤之间的差异。结果和分析1.面部影像和组织学染色分析:血管型黑眼圈的下眼睑中内侧及下睑缘皮肤出现了紫色阴影;色素型黑眼圈上下眼睑皮肤均有棕黑色色素沉着,中间半区稍严重。HE染色和FeSO4染色结果类似,黑色素颗粒主要集中在下眼睑皮肤的表皮基底层,并在真皮层散在出现;血管型黑眼圈皮肤黑色素颗粒的分布特征与正常下睑皮肤相似,只是黑色素颗粒的密度略有增加;色素型黑眼圈皮肤的真皮层中散在分布的黑色素颗粒更为集中,呈色素沉着团块。2.Pump-probe图像对于黑色素成像的特异性与准确性分析:在pump-probe图像中,基底细胞层的黑色素表现为一层明亮的绿色光点,其形态具有典型的乳头状突起;真皮层也可以看到散在分布的黑色素颗粒。pump-probe图像与FeSO4染色在同一区域内显示了同样精确的细节,皮肤组织切片的瞬态吸收光谱曲线与纯黑色素标准品的光谱曲线基本一致。因此,确认实验样本的pump-probe图像中的目标信号区域确为黑色素颗粒。pump-probe图像与FeSO4染色的MCI值的ICC为0.997（p＜0.001）,具有较高的一致性,说明pump-probe成像方法对黑色素的定量分析是可靠的。同时,MCI值与L*值呈负相关,并且L*值分别和pump-probe图像MCI以及FeSO4染色MCI的线性拟合拥有几乎一致的斜率,这说明pump-probe成像方法对于黑色素成像及定量具有较高的准确性。3.不同类型黑眼圈皮肤的量化分析:与血管型黑眼圈皮肤和正常皮肤相比,色素型黑眼圈皮肤MCI和MFI值均明显升高且有统计学差异（p＜0.05）;血管型黑眼圈皮肤的MCI和MFI值也略高于正常皮肤,但不具有统计学意义。在pump-probe图像中,色素型黑眼圈表皮基底层的MCI值达到4.28-6.04%,MFI值达到2628.63-2789.21（AU）;同时真皮浅层的MCI值达到1.90-3.50%,MFI值达到2714.44-2837.52（AU）。色素型黑眼圈皮肤的SAAID值显著低于血管型黑眼圈皮肤（p＜0.05）,在-0.44到-0.20之间波动,说明色素型黑眼圈皮肤的真皮胶原纤维含量比例显著低于血管型黑眼圈皮肤;血管型黑眼圈皮肤的OICB值显著高于正常下睑皮肤（p＜0.05）,在0.47到0.79之间波动,说明血管型黑眼圈皮肤的胶原纤维束的排列方向更加一致,更容易透过自然光线,从而更衣显露出眼轮匝肌和皮下血管的紫色阴影状态。4.不同年龄黑眼圈皮肤的组织学染色与SHG与TPEF图像分析:不同年龄黑眼圈皮肤的HE染色结果显示,随着年龄的增加,表皮基底层的不规则乳头状突起逐渐趋于平缓甚至完全扁平;表皮层的细胞数量及层次逐渐减少,厚度也逐渐降低;真皮层的纤维组织逐渐变得松散纤细,甚至出现较大空隙。以胶原纤维信号为主的SHG信号和以弹性纤维信号为主的TPEF信号互相交织,形成空间网络架构;随着黑眼圈患者年龄的增长,真皮浅层SHG信号逐渐减少,胶原纤维束的结构逐渐变得稀疏,体积和密度明显变小,荧光强度也明显降低。并且,随着年龄的增加,SAAID值逐渐降低,而OICB值逐渐增大,且在不同年龄段之间存在显著性差异（p＜0.05）。这说明胶原纤维随着老化损伤而含量降低,且排列方向更加趋于一致。这是由于胶原纤维束的含量以及真皮厚度随年龄增加而降低,导致纤维束被压缩而更加平直。结论1.本研究使用pump-probe成像技术对黑眼圈皮肤及正常下睑皮肤进行分析研究,结果发现pump-probe图像与FeSO4染色结果具有较高的一致性,证实该方法在黑色素颗粒的定量方面是可靠且准确的。2.本研究还采用SHG和TPEF技术对黑眼圈皮肤与正常下睑皮肤进行联合成像,发现以胶原纤维信号为主的SHG信号和以弹性纤维信号为主的TPEF信号互相交织,形成空间网络架构。3.黑眼圈皮肤成分的量化分析发现,色素型黑眼圈皮肤MCI和MFI值显著增高,SAAID值显著低于血管型黑眼圈皮肤,血管型黑眼圈皮肤OICB值显著高于正常下睑皮肤。4.不同年龄黑眼圈皮肤的SHG与TPEF图像显示,随着黑眼圈患者年龄的增长,胶原纤维含量逐渐降低,但是排列方向更加趋于一致。5.年轻的临床医生可以在无创、无固定、无标记的条件下,借助MPM对黑眼圈进行诊断分类和不同皮肤层次黑色素的量化,从而选择不同治疗深度的激光器或不同治疗剂量的填充物等治疗方案。