论文部分内容阅读
目的：本实验探讨了缺血预处理对肾缺血-再灌注损伤的保护作用，通过与单纯缺血-再灌注相比较，从生化、细胞组织和蛋白水平阐明缺血预处理抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的作用，为抗肾脏缺血-再灌注损伤提供新的策略和实验依据。方法：选用36只SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠(SD大鼠，250-300g)，随机分为3组。假手术组(Sham operated control，Sham组，n=12)：大鼠常规麻醉后行开腹手术，立即切除右肾用作正常肾脏标本，游离左侧肾蒂血管，不夹闭，观察73min关闭腹部；缺血-再灌注组(Ischemia Reperfusion，I/R组，n=12)：切除右肾，左肾蒂血管分离，观察28min后用无损伤动脉夹持续夹闭左肾蒂血管45min后，恢复左肾血流，关闭腹部；缺血预处理组(Isehemic Preconditioning，IPC组，n=12)：立即切除右肾，左肾蒂血管分离，行4个循环夹闭左肾蒂血管2min/再灌注5min预处理后，无损伤动脉持续夹闭45min，恢复左肾血流，关闭腹部。各组于再灌注后4h、6h、24h三个相应时间点采血和收获肾脏标本。本研究分为两个部分：1.缺血预处理抗大鼠肾缺血-再灌注损伤作用应用全自动生化分析仪测定血清肌酐(Serum creatinine，SCR)、尿素氮(Blood UreaNitrogen，BUN)评价肾脏功能；Hematoxylin and eosin染色（HE染色）观察肾组织病理形态学改变，评价缺血预处理抗大鼠肾脏缺血-再灌伤作用。2.缺血预处理抗大鼠肾缺血-再灌注损伤的相关蛋白研究2.1从抗细胞凋亡途径研究缺血预处理抗大鼠肾脏缺血-再灌注损伤作用应用末端脱氧核苦酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nickend labeling，TUNEL法)检测大鼠肾组织细胞凋亡发生情况；采用免疫印迹（westernblot）法分别测定凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达情况，透射电镜观察肾脏组织凋亡现象。2.2从自噬相关途径研究缺血预处理抗大鼠肾缺血-再灌注损伤作用采用western blot法测定自噬相关蛋白Beclin-l的表达情况，透射电镜观察肾脏组织自噬现象。结果：1.缺血预处理抗大鼠肾缺血-再灌注损伤作用①肾功能的评价：sham组BUN水平在假缺血再灌注后4h，6h，24h三个时间点分别为7.72±0.66mmol/L、9.73±1.23mmol/L、9.68±1.50mmol/L， SCR水平为61.13±10.33μmol/L、61.38±9.14μmol/L、87.48±16.50μmol/L；IPC组BUN水平在缺血再灌注后4h，6h，24h三个时间点分别为9.80±0.75mmol/L、14.13±2.30mmol/L、20.37±4.23mmol/L， SCR水平为86.88±16.94μmol/L、92.55±25.41μmol/L、171.83±33.22μmol/L；I/R组BUN水平在缺血再灌注后4h，6h，24h三个时间点分别为10.47±0.79mmol/L、18.34±2.28mmol/L、33.42±6.41mmol/L， SCR水平为94.35±16.34μmol/L、127.43±15.28μmol/L、261.88±33.37μmol/L。肾脏缺血再灌注损伤后各组BUN，SCR水平较Sham组均有上升，差别有显著性意义(P﹤0.05)。IPC组BUN，SCR的水平于再灌注后4h较同时间点I/R组相比较差别无显著性意义，6h、24h水平较同时间点I/R组相比较差别有显著性意义(P﹤0.05)。②肾组织病理学观察：正常对照组及sham组大鼠肾组织结构基本正常，无明显差异。IPC组再灌注后4h、6h及24h组织学评分分别为4.20±0.22、4.60±0.42、5.93±0.46；I/R组再灌注后4h、6h及24h组织学评分分别为4.58±0.54、5.45±0.53、7.28±0.95；IPC组再灌注后6h、24h肾组织损伤评分较I/R组同时间点减低，有显著统计学差异(P<0.05)。2.缺血预处理抗大鼠肾缺血-再灌注损伤的相关蛋白研究①肾小管上皮细胞凋亡指数结果：肾脏再灌注4h有凋亡细胞出现，I/R、IPC组再灌注后细胞凋亡指数(AI)较sham组明显增高(P<0.05)；再灌注后6h、24hIPC组凋亡指数与同时间点I/R组凋亡指数比较明显降低(P<0.05)。②细胞凋亡相关蛋白表达情况：正常肾脏组织Bcl-2和Bax表达及Bcl-2/Bax比值较Sham组无显著差异；而与Sham组比较，I/R、IPC组再灌注后各时间点Bcl-2及Bax表达显著增强(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值增加(P<0.05)。IPC组较I/R组Bcl-2表达显著增强(P<0.05)，Bax表达明显下降(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值增加(P<0.05)。③自噬相关蛋白Beclin-l表达情况：Sham组Beclin-l表达与正常对照组肾脏比较无显著差异(P>0.05)；而与Sham组比较，I/R、IPC组再灌注后各时间点Beclin-l表达显著增强(P<0.05)。IPC组较I/R组Beclin-l表达显著增强(P<0.05)。④透射电镜观察自噬及凋亡的发生：透射电镜观察显示正常及假手术对照组肾脏组织少见自噬体及凋亡现象产生；缺血再灌注后4小时可见少量自噬体，细胞凋亡仍较难见到；至再灌注后6小时自噬小体开始增多，可见细胞凋亡；再灌注损伤后24小时，自噬体数量显著增多，细胞内出现染色质块状边集，核形态不规则的明显凋亡现象。结论：1.肾缺血-再灌注使大鼠肾功能和结构受损，表现为SCR和BUN升高，肾小球、肾小管受损。缺血预处理能降低SCR和BUN水平，减轻肾组织结构的损伤，具有显著的抗大鼠肾缺血-再灌注损伤的作用。2.大鼠肾缺血再灌注损伤可导致肾小管细胞凋亡增加，缺血预处理抗缺血再灌注损伤作用可能通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax表达来实现，缺血预处理能显著抑制肾组织细胞凋亡，上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，下调促凋亡蛋白Bax表达，使Bcl-2/Bax比值升高。大鼠肾缺血再灌注损伤能同时激活肾脏组组织自噬发生，且早于凋亡和细胞坏死前发生，缺血预处理的抗缺血再灌注损伤作用可能还与上调自噬相关蛋白Beclin-1的表达有关。