研究背景线粒体位于真核生物的胞浆内,基本作用是通过氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)产生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)来满足细胞的能量需求,有细胞的动力工厂之称。线粒体还对细胞信号传导、维持钙稳态、细胞凋亡、自噬等发挥重要的调控作用。线粒体含有超过1500种蛋白质,其中许多蛋白的表达具有组织特异性。人类的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)由16569个碱基对组成。单个细胞内存在多个mtDNA,这些mtDNA仅编码线粒体OXPHOS中13个多肽以及合成蛋白质所需的2个核糖体RNA和22个转运RNA。线粒体功能所需的大多数蛋白质是由核DNA(nuclear DNA,nDNA)编码的,可形成呼吸链复合体或其组装因子、线粒体膜蛋白、转运蛋白、网络蛋白等。因此,mtDNA以及线粒体相关的nDNA缺陷均可能引起线粒体病。线粒体病是临床表型和基因型高度异质性的以能量产生障碍为特征的遗传代谢病。线粒体病通常表现为多器官同时却不同程度受累,尤其是能量需求高的器官或组织,如肌肉、大脑;但也有些线粒体病仅影响单个器官。有些线粒体病的临床特征可以高度提示一种特定的疾病表型,如线粒体脑肌病伴高乳酸血症及卒中样发作(mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes,MELAS);然而,也有许多患者呈现出一组临床症状,这些症状提示线粒体病,但并不完全符合任何特定的疾病表型。迄今为止,线粒体病的已知致病基因已超过300个。细胞内mtDNA突变型和野生型可以共存,也就是所谓的异质性,而突变型mtDNA的比例须超过组织特异性临界阈值水平才会引起细胞生化缺陷,出现疾病表型。异质性水平的差别是导致不同患者间及同一家族不同个体间临床表型差异的主要原因之一。另外,有些mtDNA多态性变异即使不是致病性的,但却可以调控致病性mtDNA突变。已知线粒体病中约70%-85%的病例是由nDNA突变引起的。NDNA突变大多通过破坏mtDNA结构和功能的完整性而引起线粒体功能障碍。目前仍有超过50%的成年线粒体病患者,甚至更大比例的儿童线粒体病患者尚未能明确线粒体病的分子遗传学诊断。因此线粒体疾病的研究道路是漫长而复杂的,因为相同的遗传和生化缺陷可以出现在各种表型中,反之亦然。Leigh综合征(Leigh syndrome,LS)是婴幼儿期最常见的线粒体脑病,发病率约为1/40,000。LS具有丰富的表型和基因型异质性。LS常见的临床表现为运动和精神发育迟滞或倒退、喂养困难、肌张力减低、共济失调等,病程呈进行性发展,预后差,病死率高,患儿通常于症状起始后的2年内死亡,但也有晚发病例或病程相对缓和者。LS已知的致病基因超过75种,可呈母系遗传、常染色体遗传或X染色体连锁遗传。随着分子遗传学的发展,已知致病基因的数量仍在增加。由于对LS的临床表型和基因型间的相关性了解不足,临床医生容易将LS误诊为其他疾病或将类似疾病误诊为LS。LS尚无有效的治愈方法,当前的临床管理主要集中于缓解症状。患有LS的患儿给父母带来了相当大的心理压力及经济负担。另外,我们在临床工作中还遇到了 1例携带mtDNAG14459A突变的特殊线粒体脑病患者。到目前为止,国内外已报道的mtDNA G14459A突变引起的临床表型有 Leber 遗传性视神经病(Leber hereditary optic neuropathy,LHON)、肌张力障碍、Leber遗传性视神经病伴肌张力障碍(LHON plus dystonia,LDYT)、LS和无症状。但该患者具有特殊的临床特征、神经影像和分子遗传学特点。本研究主要针对这两方面进行研究。第一部分 Leigh综合征患者的临床、神经影像、病理与基因分析目的本研究旨在分析经基因检测确诊的LS患者的临床表现、神经影像、生化、肌肉组织病理及基因型特点,为该病的早期诊断提供临床经验。方法本研究选取2000年1月到2018年12月就诊于山东大学齐鲁医院神经内科确诊为LS的患者为研究对象,根据Baertling等提出的诊断标准,患者同时满足:(1)LS进行性发展的多种神经症状,(2)由于遗传基因缺陷引起的线粒体功能障碍,(3)伴有双侧中枢神经系统LS诊断性影像改变(脑干和/或基底节对称性病变)。并排除:(1)病史、查体资料不完整者;(2)其他疾病:如感染、肿瘤、炎症、中毒、缺血缺氧等及确诊的其他遗传代谢性疾病;(3)拒绝知情同意及家系验证者。提取LS患者外周静脉血或活检骨骼肌组织的DNA,对mtDNA“3243”、“8344”、“8993”和“10191”位点进行Sanger测序,测序阴性的患者及部分患者直接进行mtDNA全长和/或线粒体相关核基因二代测序以明确致病基因,分析患者的基因型特点。分析基因检测诊断LS患者的临床表现、颅脑MRI(magnetic resonance imaging)、生化检验特点。用气相色谱-质谱和串联质谱技术分析患者的尿有机酸,血氨基酸及脂酰肉碱水平。并对患者的活检骨骼肌标本进行组织染色,分析肌肉病理特点。结果1、人口学资料:经基因测序证实为LS的患者共16例(男:女=10:6)。起病年龄自出生后3个月到10岁不等,中位起病年龄32个月;其中小于2岁的早发型患者共6例(37.5%,男:女=1:5),超过2岁的晚发型患者共10例(62.5%,男:女=9:1),性别在早发和晚发型患者间有统计学差异。2例nDNA突变患者的起病年龄均小于1岁;14例mtDNA突变者10例为晚发型,4例为早发型,有1例患者的表型符合LS/MELAS叠加综合征。2、临床表现:16例患者首发症状为生长和智能发育落后3例、斜视3例、震颤3例、行走不稳2例、睑下垂2例、喂养困难1例、运动不耐受1例、腹痛1例。就诊时常见的临床表现有肌无力(10/16,62.5%)、眼科异常(10/16,62.5%)、肌张力减低或增高(9/16,56.3%)、腱反射异常(7/16,43.8%)、共济失调(6/16,37.5%)、震颤(6/16,37.5%)、智能减低(5/16,31.3%)、身材矮小(4/16,25%)、呼吸窘迫(4/16,25%)、癫痫发作(1/16,6.5%)等。10例眼科异常的患者中斜视8例、睑下垂4例、眼球震颤3例、视神经萎缩1例,而且早发型和晚发型患者分别为2例和8例。4例呼吸窘迫者中有3例为起病年龄小于1岁的早发型患者。但除6例共济失调患者均为晚发型,有统计学差异外,肌无力、眼科异常等在早发与晚发患者间均未达到统计学差异。LS患者可同时合并有肾小管酸中毒、糖尿病、左室心肌致密化不全、预激综合征、心脏房室传导阻滞等多脏器受累的表现。3、颅脑MRI:病变部位最多见于脑干(14/16,87.5%),尤其是中脑(14/16,87.5%),其次是基底节(8/16,50%)、丘脑(8/16,50%)、小脑(5/16,31.3%)、幕上白质(2/16,12.5%)及皮层(2/16,2.5%)。有4例丘脑受累的患者不合并基底节病变。病变分布在早发型与晚发型患者间无统计学差异。4、生化检验:16例患者就诊时均行静息状态血乳酸测定,升高者共8例(8/16,50%);8例患者行脑脊液乳酸水平测定,升高者有7例(7/8,87.5%)。5例患者行尿液有机酸检查结果显示l例患者有3-羟基丙酸和3-甲基戊烯二酸水平升高(1/5);4例患者行血氨基酸及脂酰肉碱检查,结果均无异常。5、骨骼肌组织病理:共9例患者接受骨骼肌活检,肌肉组织病理示有2例患者有破碎红纤维(red ragged fiber,RRF)、1例患者有肌纤维肌膜下红染,且他们活检时年龄均在9岁以上;2例患者有不同程度的细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)活性减低或缺失。肌纤维内脂滴的增多也常见。6、基因特点:16例LS患者中,mtDNA突变者14例,nDNA突变者2例。在mtDNA突变者中,MT-NDs基因突变者共9例,分别为3例MT-ND3基因的T10191C 突变、1 例 MT-ND4 基因的 C11777A 突变、1 例 MT-ND4 基因的 G11778A突变、3例MT-ND5基因的G13513A突变和1例MT-ND6基因的G14459A突变;MT-ATP6基因突变者共4例,分别为3例T8993C突变,1例T9185C突变;MT-TLI基因的A3243G突变者1例。2例nDNA突变分别位于NDUFAF5基因(c.145C>T和c.238G>C)和SDHA基因(c.163T>C和c.934C>T),这4种变异类型均未曾报道过。7、随访:LS中有随访数据的共有10人,4例患者分别在诊断后的1个月、3个月、6个月、6年死亡,而且前3例均为早发型患者并首次就诊时有呼吸窘迫。6例患者随访3个月到4年不等,病情尚稳定或呈进行性发展。结论1、本研究中,mtDNA突变的LS患者以晚发型居多。早发型LS以女性多见,晚发型LS以男性多见。2、肌无力和眼科异常是LS最常见的临床表现,后者以斜视最多见,而癫痫发作并不常见。共济失调多见于晚发型患者,有呼吸障碍的早发型患者病情更重,预后更差。3、脑干尤其是中脑是LS最常见的病变部位,其次为基底节和丘脑,丘脑的病变可不伴随基底节的病变出现。脑脊液乳酸水平测定虽非必须具备,但对线粒体疾病的诊断仍有一定的临床意义。4、LS患者的骨骼肌病理中典型的RRF少见。临床怀疑LS者,建议行mtDNA全长和/或线粒体相关核基因二代测序。MT-ATP6、MT-ND3和MT-ND5基因是LS的最常见mtDNA突变基因,T8993C、T10191C和G13513A突变是LS的热点突变,尤其是晚发型患者可重点筛查。尽早明确LS的分子诊断并及时治疗,有望延长患者的寿命、改善其生活质量。第二部分 线粒体基因G14459A突变引起的特殊临床表型的机制研究目的报道1例携带mtDNA G14459A突变及mtDNA A6064T突变患者的特殊线粒体病表型,并研究分析G14459A突变的致病性。方法收集1例反复就诊于我院以“视力下降”起病的青年女性患者的临床资料。并行骨骼肌活检和mtDNA全长测序。采集患者的外周静脉血,培养永生化淋巴细胞,并通过将来源于患者血小板的线粒体导入mtDNA缺失ρO细胞的方法来构建融合细胞(cybrid)模型。将携带同质性G14459A突变的融合细胞作为突变型组,无G14459A突变的融合细胞作为野生型组。用分光光度计法测定永生化淋巴细胞线粒体呼吸链复合体活性。用海马细胞能量分析仪测定融合细胞氧气消耗速率(oxygen consumption rate,OCR)。共聚焦显微镜观察分析融合细胞的线粒体膜电位水平和细胞内的活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量。结果患者,女,22岁,自幼生长发育基本同同龄人。患者15岁时出现双眼无痛性视力下降,18岁时出现强直阵挛性癫痫发作,右上肢及左下肢的不自主抖动,持物及书写时右上肢抖动明显,并行走不稳。神经系统查体显示患者的智能无明显减退,简易精神状态检查量表得分为28分,构音障碍,右上肢及左下肢肌张力障碍,意向性震颤,共济失调。患者双眼视力0.1,眼底照相见双眼视盘颞侧象限苍白,光学相干断层显像显示双眼视神经纤维层除鼻上侧象限外均变薄。患者的脑脊液乳酸2.7mmol/L。患者18岁时的颅脑MRI见病变位于双侧中央前回皮质,并无基底节受累。21岁时颅脑MRI显示除中央前回病灶外,双侧基底节可见以壳核为主的对称性病变。肌肉活检组织病理未见明显RRF和COX缺失纤维。线粒体基因全长测序及Sanger测序证实患者有MT-ND6基因的异质性G14459A突变,同时发现有MT-COI基因的接近同质性的A6064T突变。患者的一胞弟4岁时因“发热、四肢无力、呼吸困难”去世。另一胞弟目前7岁尚无症状。患者母亲的视力左眼0.7、右眼0.8,眼底照相示双眼视盘苍白。患者的母亲及7岁胞弟也携带G14459A突变和A6064T突变。患者的永生化淋巴细胞呼吸链复合体I的活性较正常对照减低了 50%,复合体II、III和IV的活性较正常对照无明显差异。海马细胞能量分析显示同质性G14459A突变型融合细胞的基础OCR、最大OCR及ATP偶联OCR较野生型融合细胞分别下降55.8%、56.3%和60.3%。突变型融合细胞的线粒体膜电位水平较野生型融合细胞降低了 64%。另外,突变型融合细胞的ROS产量较野生型融合细胞增加了 l 04%。结论1、本研究首次报道了 mtDNAG14459A突变引起的以视力下降、非儿童期起病的肌张力障碍及癫痫发作为临床特征的特殊线粒体病表型,且患者双侧额叶皮质病变先于基底节对称性病变出现。本研究进一步扩大了 mtDNAG14459A突变的临床表型谱。2、MtDNAG14459A突变可使线粒体呼吸链复合体I的活性下降,线粒体膜电位水平减低,ROS的产生量增加,导致细胞呼吸功能缺陷,引起该特殊临床表型。另外,患者同时合并一未曾报道过的mtDNAA6064T突变,该突变可能会影响G14459A突变的临床表型,尚需进一步研究。