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最近的研究表明,IKBKE(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit epsilon)已经证实在多种恶性肿瘤中高表达,且沉默IKBKE蛋白表达可以抑制肿瘤进展。在本篇文章中,我们首先使用CCK-8检测方法计算CYT387对2种代表性的胶质母细胞瘤细胞系U87-MG及LN229的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)确定胶质母细胞瘤对此种小分子敏感;并且验证CYT387,作为一种潜在的IKBKE抑制剂,能够显著地抑制胶质瘤细胞系细胞的增殖、迁移以及侵袭能力。此外,CYT387还可诱导细胞凋亡和并使细胞周期阻滞在G2期。与此同时我们发现,沉默IKBKE蛋白含量可以增强Hippo通路,降低Hippo通路下游因子的转录水平。另外,我们证实了CYT387不仅仅抑制IKBKE激酶活性同时也降低其在蛋白水平的表达,而这种改变不涉及IKBKE mRNA水平。接下来,通过免疫印迹的办法证实了CYT387从剂量及时间依赖性上促进Hippo信号通路来控制肿瘤的恶性进展。为探查更深一步的机制,我们使用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,co-IP)的方法及特异性磷酸化抗体证实了IKBKE与YAP1及TEAD2相互作用,促进YAP1及TEAD2入核,调控肿瘤增殖生长。在接下来的体内中,我们发现CYT387能明显抑制裸鼠皮下肿瘤的生长但无法遏制颅内肿瘤的生长,这可能是由于CYT387穿透血脑屏障(blood brain barrier,BBB)差造成的。这些结果表明,CYT387有可能成为新的抗胶质瘤靶向药物但需要寻求通过血脑屏障的方法。方法 我们使用CCK-8检测方法设立不同药物浓度,通过检测一定药物浓度梯度下肿瘤细胞成活率,确定胶质母细胞瘤细胞系U87-MG及LN229在不同时间下的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。我们使用CCK-8的检测方法及克隆形成实验测定小分子抑制剂CYT387对肿瘤细胞增殖能力;利用划痕试验及transwell方法检测药物对胶质瘤细胞系迁移及侵袭能力的影响。接下来应用流式细胞仪检测小分子抑制剂CYT387对胶质瘤细胞凋亡及周期的影响;并通过免疫印迹的方法,检测相应周期蛋白及凋亡蛋白的表达;那下面,机制的研究中,我们先使用IKBKE-shRNA沉默IKBKE的蛋白表达,检测Hippo通路核心蛋白LATS2,YAP1,TEAD2,p-YAP1磷酸化127位点及下游效应蛋白Axl,c-myc的表达含量的变化,并通过使用重组质粒过表达IKBKE的蛋白含量,重新检测Hippo通路核心蛋白及下游效应蛋白表达变化,并使用小分子抑制剂CYT387从剂量及时间依赖性上处理胶质瘤细胞系检测这些指标的变化;在接下来对进一步机制的研究中,我们使用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,co-IP)的方法,从内源性及外源性两个方面说明IKBKE与YAP1,TEAD2存在相互结合的作用;分别提取胞浆及胞核蛋白,分别使用免疫印记的方法说明沉默IKBKE可以抑制YAP1及tead2入核启动转录过程,并应用免疫荧光的办法说明沉默IKBKE可以抑制YAP1的入核;使用real-time RT-PCR证实IKBKE改变YAP1,TEAD2的含量是否牵扯到转录或者翻译水平。使用U87-MG细胞注射4-5周大小裸鼠皮下建立裸鼠皮下肿瘤模型,模型建立一周后使用灌胃针经口灌胃CYT387(100mg/kg/day),饲养30天监测皮下肿瘤大小,随后处死全部裸鼠,获取对照组与实验组全部肿瘤称重,免疫组化的方法检测IKBKE,凋亡,周期,Hippo通路及下游因子指标变化;随后使用感染了luciferase病毒的U87-MG细胞在立体定向仪的辅助下建立裸鼠颅内肿瘤模型,实验组每天灌胃药物CYT387(100mg/kg/day),每7天使用活体荧光成像仪监测颅内肿瘤大小,监测裸鼠体重及裸鼠存活情况,取鼠脑切片做免疫组化染色确定指标变化。结果 1,胶质瘤细胞系U87-MG及LN229对CYT387十分敏感,经CYT387处理后胶质瘤细胞增殖及集落形成能力大大降低。2,CYT387可以明显抑制胶质瘤细胞系U87-MG及LN229迁移及侵袭能力。3,CYT387可以促进胶质瘤细胞系U87-MG及LN229凋亡。4,CYT387促进胶质瘤细胞系U87-MG及LN229周期阻滞,使肿瘤阻滞于G2期。5,CYT387不仅可以抑制IKBKE激酶活性还可以降低IKBKE蛋白表达含量,这种改变主要是翻译后的修饰,在转录水平无明显影响。6,CYT387通过抑制IKBKE表达及活性增强Hippo通路抑制恶性胶质瘤细胞生长。7,IKBKE可以与YAP1及TEAD2直接作用影响Hippo通路,沉默IKBKE可以抑制YAP1及TEAD2向细胞核内转座。8,CYT387可以抑制裸鼠皮下肿瘤生长但对裸鼠颅内原位肿瘤的抑制效果不明显。结论 1,CYT387在体外实验中可以明显抑制胶质母细胞瘤细胞系U87-MG及LN229的生长;促进其凋亡;2,CYT387可以活化Hippo通路抑制肿瘤细胞的生长,而这一作用主要是通过减低IKBKE激酶的活性及表达量实现的。3,IKBKE可与YAP1及TEAD2相互作用,促进YAP1及TEAD2向细胞内转座从而影响Hippo通路从而控制胶质瘤进展;4,CYT387可以抑制皮下肿瘤的生长但对颅内肿瘤影响效果不明显,可能与其透过血脑屏障差有关。