研究背景脑卒中目前已成为危害人类生命健康的主要疾病之一,其主要包括出血性卒中和缺血性卒中,出血性卒中主要包括脑实质性出血、自发性脑室出血和蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)。脑实质性出血主要由高血压、脑血管畸形、血管淀粉样变性等引发的血管破裂出血产生血肿压迫脑组织,进而引起继发性脑损伤。目前对于出血性脑卒中的治疗措施主要包括积极治疗内科原发疾病,开颅血肿清除,微创血肿穿刺等。而对于SAH及原发性脑室出血导致血液破入蛛网膜下腔引起的广泛性、迟发性脑损伤,特别是急性期损伤所致的不良预后,目前仍无良策,是当前研究的重点。SAH是一种高死亡率疾病,主要是由颅内动脉瘤破裂引发,大约占脑卒中的3-5%,近半数患者年龄在55岁以下,其引发的继发性脑损伤是患者致残和死亡的关键因素,因而对SAH后继发脑损伤的研究成为神经科学领域的热点。SAH后72 h内的损伤称为早期脑损伤(early brain injury,EBI),是导致患者预后不良的首要因素。SAH病理过程复杂,主要包括血管痉挛、细胞凋亡、颅内高压、神经炎症、氧化应激、脑水肿、血脑屏障破坏等。目前,缺乏显著改善患者预后的临床治疗方法。而缺血性脑卒中总的发病率明显高于出血性脑卒中,已占到所有脑卒中的75%。过去,缺血性中风主要由血栓形成和血管阻塞引起。其中,由前端循环血液供应系统引起的大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)占缺血性中风的大多数病理类型。而且发病机理很复杂,通常伴随着各种炎症介质的释放;炎性细胞的浸润和积累;血脑屏障的破坏;炎症因子的分泌和黏附分子的大量释放。缺血性脑卒中的主要治疗措施包括药物治疗、介入治疗及去骨瓣减压等一系列恢复血流及缓解脑受压等措施。但血流恢复后引起的缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)引发的神经功能缺损仍是临床医生棘手的问题。脑缺血后强烈的炎症反应及细胞凋亡是继发性脑损伤的主要原因,在脑缺血和CIRI中起着重要作用。虽然血管内机械取栓或溶栓的时间窗口已经得到延长,但取栓过程中导致的血管破裂出血及其后的康复仍然是困扰神经界的最大问题。因此,考虑到缺血性脑卒中的病理生理学过程的复杂性,目前尚未找到全面有效的治疗措施。因此,对脑缺血及CIRI的分子机制进行了探讨将为脑缺血后的早期干预提供重要的临床应用指导。脑组织微环境的变化在脑卒中后脑损伤中起着重要作用,尤其是炎症反应,贯穿整个病理过程而且严重影响病人预后。小胶质细胞是中枢神经系统(central nervous system,CNS)中常驻的免疫细胞,属于单核吞噬系统,主要参与神经炎症反应。在生理状态下,小胶质细胞通过监测病原体和与损伤相关的分子模式,吞噬凋亡神经元维持体内平衡发挥作用。小胶质细胞可以根据微环境信号的变化调整其表型,包括经典激活的M1表型和替代激活的M2表型。M1表型小胶质细胞可产生肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、干扰素-α(interferon alpha,IFN-α)、诱导性一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等促炎因子,对神经元产生毒性和组织炎症损伤。M2表型小胶质细胞可分泌抗炎因子,如转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)、精氨酸酶-1(argininase-1,Arg-1)、胰岛素样生长因子 1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)等,可对神经元损伤起到保护作用。小胶质细胞的活化状态和极化表型转变在脑损伤后的神经炎症反应中起着至关重要的作用,特别是对于顶叶皮层区(parietalcortex,PC)和海马(hippocampus,HP)区的小胶质细胞,PC 区和 HP区在脑卒中后患者神经认知方面发挥极其重要的作用,如何改善脑卒中后的早期脑损伤,尤其是神经炎症导致的损伤,是目前研究的重点。在神经炎症反应中,M1表型和M2表型小胶质细胞通常共存,可根据不同的表面标志物加以区分,CD16、CD206分别主要在M1、M2表型小胶质细胞膜上表达。M1表型小胶质细胞在神经炎症早期所占比例较高,而M2表型小胶质细胞主要出现在神经炎症晚期。因此,在炎症反应的早期阶段将小胶质细胞从M1表型转化为M2表型,从而恢复免疫平衡,对于改善脑卒中患者的神经功能至关重要。在脑卒中的诸多治理措施中,干细胞及其相关治疗日益显示出强大的优势。干细胞可通过移植到宿主体内后释放多种生物活性因子发挥其神经保护作用,但干细胞治疗也存在许多弊端,无论是局部还是全身给药,干细胞真正到达损伤部位的数量十分有限,且在损伤部位的存活时间非常短暂,同时不易通过体内屏障系统,而且存在致瘤风险。间充质干细胞(mesenchymal Stem cells,MSCs)可分泌多种生物活性物质并靶向至脑内损伤区域,包括营养因子和细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs),其与神经发生、血管生成和神经保护密切有关。细胞外囊泡是大多数活细胞在自然条件下都可以产生的一种膜性囊泡,根据大小和来源的不同,可以大致分为凋亡小体(直径800-5000 nm)、微囊泡或脱落囊泡(直径50-1000 nm)和外泌体(直径40-100 nm)。细胞外囊泡由于具有良好的循环稳定性和相比于干细胞较低的免疫原性,以及易于透过体内屏障系统,便于储存和运输等巨大优势,其作用范围比干细胞更加广泛,在生物治疗领域具有巨大的潜力,同时,其又可克服细胞治疗带来的相关的局限性和潜在风险。研究证明,从间充质干细胞中提取的细胞外囊泡(extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells,MSCs-EVs)可很好的保持与亲代细胞相似的生物活性,如向炎症部位归巢调节免疫应答及参与组织修复等作用。在脑卒中治疗方面,MSCs-EVs已展现出强大的神经保护作用,MSCs-EVs的应用可促进脑卒中后神经血管重构和神经功能恢复。在脑卒中后的炎症反应及凋亡信号通路中,涉及到几个重要的信号通路。其中,核因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)长期以来一直被认为是一种经典的炎症信号相关通路,NF-κB的激活可促进细胞因子、化学因子和黏附分子的表达及分泌。作为细胞内重要的核转录因子,NF-κB可通过靶向该途径减少炎症细胞的渗透和凋亡。而腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)作为一种重要的丝氨酸/肌氨酸蛋白激酶,可被抗炎因子刺激迅速激活,被促炎因子迅速灭活。当细胞能量供应减少时,AMPK的激活可通过减少能量消耗和增加能量利用率来维持细胞代谢平衡,从而促进脑卒中后神经功能的修复。同时,AMPK的激活已被证明是NF-κB的负性调节器,是调节促炎因子表达的关键转录因子及巨噬细胞炎症信号通路的一种有效反向调节器。另外,Janus激酶/信号转导子和转录激活子(Janus kinase/signal transducers and transcriptional activators,JAK/STAT)信号通路家族的激活是大多数细胞因子发挥其生物功能的重要途径,在大脑中广泛表达,在神经炎症和凋亡中起着至关重要的作用。在JAK/STAT家族中,JAK2/STAT3通路是最保守且与CNS炎症和氧化应激的病理生理学密切相关的途径。JAK2蛋白的活化可引发STAT3的磷酸化。JAK2/STAT3信号通路对脑外伤和脑缺血后神经功能恢复有重要影响。本课题以MSCs-EVs作为研究中心点,以AMPK作为研究靶点,采用血管穿刺法及线栓堵塞大脑中动脉法分别建立实验性SD大鼠SAH和MCAO模型,以PC区和HP区作为主要的研究区域,遵循大体病理,组织病理和分子病理的研究路线,详细研究MSCs-EVs对SAH和MCAO后神经保护作用,揭示MSCs-EVs通过减轻神经炎症、促进小胶质细胞向M2表型极化、减轻神经细胞凋亡发挥神经保护作用的相关机制。通过本课题的研究,可对SAH和MCAO发生后早期神经功能保护提供全新的干预手段和作用靶点,对推动临床医疗的发展具有鲜明的指导价值。第一部分MSCs来源的细胞外囊泡通过调控AMPK通路对大鼠SAH后的神经保护作用及机制研究1.1研究目的(1)明确SAH后EBI阶段的基本病理改变和神经功能损伤,同时应用MSCs-EVs干预SAH组大鼠模型,以PC和HP区为代表,检测MSCs-EVs对SAH发生后的脑组织病理损伤的改善性作用。(2)分析MSCs-EVs对大鼠SAH后脑损伤保护作用的分子机制及相关信号通路。(3)明确MSCs-EVs可以通过影响EBI来改善神经功能损伤,并阐明相关信号通路的改变。1.2研究方法(1)构建稳定的实验性SAH大鼠模型选用198只4周龄的SPF级健康成年雄性SD大鼠,体重在280-350 g之间,采取改良血管穿刺法建立SAH动物模型,改良血管穿刺法建立的SAH模型可最大程度上模拟临床上颅内动脉瘤破裂出血导致的SAH引发的广泛性神经损伤。(2)MSCs-EVs的提取及鉴定提取大鼠股骨与胫骨骨髓腔内的MSCs进行培养,第3代后更换无EVs培养基继续培养48 h,通过梯度离心培养基的方法获得高纯度的MSCs-EVs。利用透射电镜、qNano和Western blot对MSCs-EVs进行鉴定。(3)动物分组方式、MSCs-EVs的注入和动物处死采用随机数法,在本研究中,大鼠被随机分成5组:(1)假手术(Sham)组,(2)SAH 24 h 组,(3)SAH 24 h+MSCs-EVs 组,(4)SAH 48 h 组,(5)SAH 48 h+MSCs-EVs组。(3)组和(5)组中每只大鼠在SAH建模成功后10 min内通过尾静脉注射含有100 μg MSCs-EVs的PBS悬液,其余各组均注射等体积的无菌PBS作为对照。在相应时间点,采用腹腔注射致死剂量水合氯醛的方式处死实验动物进行下一步实验。(4)MSCs-EVs对SAH动物大体病理的影响随时观察动物生存情况,及时剔除死亡大鼠,在相应时间节点,处死各组动物前,借助改良神经评分量表,检测各组动物神经行为学改变,颅底蛛网膜下腔出血量和脑水含量,比较SAH+MSCs-EVs组和SAH组之间的差异。(5)MSCs-EVs改善SAH后神经元损伤处死实验动物后,制作全脑组织石蜡切片,通过免疫组化观察各组PC和HP CA1区小胶质细胞激活及形态学分析;主要观察目标为区域离子钙结合调节分子(ionized calcium binding adaptor molecule-1,Iba-1)阳性小胶质细胞的相对数量以及小胶质细胞面积,直径和周长的分析。(6)基因和蛋白水平检测MSCs-EVs调控SAH后炎症因子指标,明确相关信号通路实验动物处死后,收集损伤侧PC和HP区脑组织,分别提取总mRNA和蛋白上清,采用逆转录PCR和Western blot技术检测M1、M2表型小胶质细胞表面标志物及炎症指标IL-1β等炎症因子在各组动物模型中的表达情况,通过Western blot检测MSCs-EVs调控SAH后炎症反应可能的信号通路中关键蛋白表达。(7)统计分析数据分析采用SPSS软件(版本22,IBM,纽约,美国)。数据以均数±标准差表示,数据均使用单因素方差分析(one-way ANOVA)并结合事后分析(post-Bonferroni)进行分析。P<0.05为有统计学意义。1.3结果(1)MSCs-EVs 的鉴定透射电镜下观察显示:MSCs-EVs为杯状均匀球形囊泡状结构。通过Western blot技术可检测到MSCs-EVs特征性标志物TSG101和CD9的表达,而内质网应激蛋白(Celnexin)的表达量极少。粒径分析结果显示大多数MSCs-EVs的直径在60-150 nm之间,结果表明提取的MSCs-EVs符合实验要求。(2)MSCs-EVs对大鼠SAH后神经功能缺损和脑含水量的影响采用改良Longa评分系统由两名对本实验均不知情的实验人员对各组大鼠分别进行神经行为学评分并独立记录,于Sham组相比,SAH组的神经功能评分在术后24 h、48 h均明显降低(P<0.05),MSCs-EVs组相较SAH组在48 h时神经功能评分提高,差异具有统计学意义(P<0.05),同时进一步检测脑组织水含量发现,SAH组在术后各脑区脑水含量均显著高于Sham组(P<0.01,P<0.05,P<0.01),尤以左大脑半球最为明显,SAH组在术后24 h、48h后左大脑半球脑水含量分别是Sham组的1.08和1.15倍。而经MSCs-EVs干预的SAH大鼠在术后各脑区脑水含量明显降低(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。(3)MSCs-EVs对大鼠SAH后蛛网膜下腔出血量的影响与Sham组相比,SAH组大鼠术后24 h(P<0.001)和48 h(P<0.01)蛛网膜下腔出血量均明显增多;在术后48 h,与SAH组相比,MSCs-EVs组的蛛网膜下腔出血量明显减少(P<0.05)。(4)MSCs-EVs降低顶叶皮层和海马区小胶质细胞的激活与Sham组相比,SAH组PC区小胶质细胞的激活数量在SAH后24 h和48 h显著增加(P<0.001),与Sham组相比,SAH组HPCA1区小胶质细胞的激活数量在SAH后24 h和48 h显著增加(P<0.01;P<0.001),与SAH组相比,MSCs-EVs组PC区、HP CA1区小胶质的激活量较SAH组明显减少(48 h:P<0.001)。(5)MSCs-EVs促进小胶质细胞M2方向极化,抑制神经炎症反应与Sham组相比,SAH组中PC区M1型小胶质细胞表面标志物iNOS(24h:P<0.01;48 h:P<0.001);CD16(24 h:P<0.05;48 h:P<0.01);CD11b(24 h:P<0.01;48 h:P<0.01)及炎症指标 IL-1β(24 h:P<0.01;48 h:P<0.001)表达水平在 SAH术后24 h和48 h后均明显升高;同样,HP区M1型小胶质细胞表面标志物iNOS;CD16;CD11b及炎症指标IL-1β表达水平也在SAH术后24 h和48 h后均明显升高(P<0.001)。与SAH组相比,MSCs-EVs组中PC区上述小胶质细胞表面标志物的表达水平明显降低,iNOS(24h:P<0.05;48 h:P<0.001);CD16(24h:P<0.05;48 h:P<0.01);CD11b(24 h:P<0.01;48 h:P<0.001);IL-1β(24 h:P<0.001;48 h P<0.001),与SAH组相比,MSCs-EVs组中HP区上述小胶质细胞表面标志物的表达水平明显降低,iNOS(24 h:P<0.001;48 h:P<0.001);CD16(24h:P<0.001;48 h:P<0.001);CD11b(24h:P<0.01;48h:P<0.001);IL-1β(24 h:P<0.001;48 h:P<0.05)。与SAH组相比,MSCs-EVs组中PC区M2型小胶质细胞表面标志物的表达水平在24 h和48 h后均明显升高,TGF-β(24 h:P<0.001;48 h:P<0.001),Arg-1(24 h:P<0.001;48 h:P<0.001),和CD206(24 h:P<0.01;48 h:P<0.001),与SAH组相比,MSCs-EVs组中HP区M2型小胶质细胞表面标志物的表达水平在24 h和48 h后均明显升高,TGF-β(24 h:P<0.05;48 h:P<0.01);Arg-1(24 h:P<0.001;48 h:P<0.001);CD206(24h:P<0.05;48h:P<0.01)。表明MSCs-EVs可起到抑制SAH诱导的神经炎症反应并促进小胶质细胞向M2表型转化的作用。免疫组化结果显示,与Sham组相比,SAH组PC区CD16+小胶质细胞数量明显增加(24 h:P<0.001;48h:P<0.01),MSCs-EVs可减少SAH 24 h和48 h CD16+小胶质细胞数量(P<0.05)。与SAH组相比,MSCs-EVs组PC区Arg+小胶质细胞数量明显增多(24h:P<0.05;48h:P<0.01)。而与Sham组相比,SAH组HPCA1区CD16+小胶质细胞数量明显增加(24h:P<0.001;48h:P<0.01)。MSCs-EVs 可减少 CD16+小胶质细胞数量(24h:P<0.05;48h:P<0.01)。与SAH组相比,MSCs-EVs组HP CA1区Arg+小胶质细胞数量明显增多(24 h:P<0.01)。(6)MSCs-EVs对SAH后顶叶皮层和海马CA1区小胶质细胞形态的影响与Sham组相比,SAH组PC区小胶质细胞的面积、直径和周长在SAH后24 h 和 48 h 均显著增加(24 h:P<0.001、P<0.01、P<0.001;48 h:P<0.001、P<0.001、P<0.001)。与Sham组相比,SAH组海马CA1区小胶质细胞的面积、直径(P<0.001)和周长(P<0.001)在SAH后24 h显著增加,与Sham组相比,SAH组海马CA1区小胶质细胞的面积(P<0.05)、直径(P<0.001)和周长(P<0.001)在SAH后48 h显著增加。与SAH组相比,MSCs-EVs的干预可使PC区小胶质细胞的面积(24 h:P<0.01;48 h:P<0.05)、直径(48 h:P<0.001)和周长(24h:P<0.001;48 h:P<0.001)在 SAH 后显著减少,与 SAH组相比,MSCs-EVs的干预可使海马CA1区小胶质细胞的面积(48 h:P<0.05)、直径(24h:P<0.001;48 h:P<0.001)和周长(24 h:P<0.001;48 h:P<0.001)在显著减少。以上实验结果进一步说明,MSCs-EVs的干预可减少SAH后小胶质细胞的激活。(7)MSCs-EVs提高SAH后AMPK的磷酸化水平以及对NF-κB信号传导的影响SAH后,AMPK和NF-κB通路的关键信号分子活化受到激活,实验结果显示,与Sham组相比,SAH组在24 h时,PC区p-AMPK的表达量升高(P<0.01);HP区中p-AMPK的表达量升高(24h:P<0.01;48 h:P<0.05);SAH组24h和48 h后PC和HP区中p-IKBα的表达量升高(PC:P<0.001;HP:P<0.01)。与Sham组相比,SAH组24 h和48 h后HP区中p-NF-κB的表达量升高(24 h:P<0.01;48 h:P<0.01)。而应用MSCs-EVs后,SAH大鼠神经元AMPK的磷酸化水平显著增高,与 SAH 组相比,MSCs-EVs进一步上调 PC 区(24 h:P<0.001;48 h:P<0.05)和HP区p-AMPK的表达(24 h:P<0.05;48 h:P<0.001)。下游的NF-κB通路的关键信号分子活化受到显著抑制,与SAH组相比,MSCs-EVs可显著降低PC及HP区中p-IKBα的表达(PC 24 h:P<0.01;48 h:P<0.001;HP 24 h:P<0.001;48 h:P<0.001)。MSCs-EVs 亦可显著降低 PC 及 HP 区中 p-NF-κB 的表达(PC 24 h:P<0.01;48 h:P<0.01;HP 24 h:P<0.05;48 h:P<0.001)。免疫组化结果显示,MSCs-EVs的干预可增加SAH后大鼠PC区及HP CA1区p-AMPK+细胞数量(PC 48 h:P<0.001;HP24 h:P<0.001;48 h:P<0.05),与 Sham 组相比,SAH 组 24 h 和 48 h 后 PC 区及 HP CA1 区 p-NF-κB+细胞数量(P<0.001),MSCs-EVs 的干预可减少SAH后大鼠PC区及HP CA1区p-NF-κB+细胞数量(PC 24 h:P<0.01;48 h:P<0.001;HP 48 h:P<0.001)。以上实验结果表明,SAH 后 MSCs-EVs 可通过激活AMPK、抑制NF-κB信号通路抑制神经炎症反应。1.4结论(1)MSCs-EVs可以通过减轻脑水含量和神经炎症,改善SAH引发的EBI程度,增加神经功能缺损评分,减轻神经功能缺损,改善神经功能。(2)MSCs-EVs发挥神经保护效应的分子机制是通过上调AMPK,下调NF-κB信号通路,从而逆转SAH引发的神经炎症,促进小胶质细胞向M2表型极化,发挥神经保护作用。第二部分MSCs来源的细胞外囊泡通过调控AMPK通路对大鼠MCAO后的神经保护作用及机制研究2.1研究目的(1)明确MCAO后大鼠基本病理改变和神经功能损伤,同时应用MSCs-EVs干预实验性MCAO大鼠模型,以PC和HP区为代表,检测MSCs-EVs对MCAO发生后的脑组织病理损伤的改善性作用。(2)分析MSCs-EVs对大鼠MCAO后脑损伤保护作用的分子机制及相关信号通路。(3)明确MSCs-EVs改善大鼠神经功能损伤的机制并阐明相关信号通路中关键蛋白表达量的改变。借助AMPK通路特异性阻断剂(compound C,CC),进一步研究AMPK信号通路在MCAO后发挥神经保护的作用机制。2.2实验方法(1)将大鼠随机分为8组:(1)Sham24h组,(2)MCAO 24h组,(3)MCAO 24 h+MSCs-EVs 组,(4)MCAO 24 h+MSCs-EVs+CC 组,(5)Sham 48 h 组,(6)MCAO 48 h 组,(7)MCAO 48 h+MSCs-EVs 组和(8)MCAO 48 h+MSCs-EVs+CC组。(4)组和(8)组的每只大鼠于MCAO术前30 min通过立体定向技术用汉密尔顿微量注射器缓慢地向其右侧侧脑室内注入CC,MSCs-EVs组中的每只大鼠在MCAO术后10 min内通过尾静脉注射含有100 μg MSCs-EVs的PBS悬液。完成各模型组实验动物的制备。(2)MCAO术后24 h和48 h,采用改良Garcia评分法对各组大鼠分别进行神经功能缺损评估并记录得分,后处死动物,分别取其左、右脑半球做脑含水量测定。(3)采用 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色观察并计算各组大鼠脑梗死体积。(4)利用HE染色在显微镜下观察各组大鼠脑组织的形态变化,在组织病理层面进行探讨。(5)利用尼氏染色(Nissl staining)在显微镜下观察各组大鼠脑组织尼氏小体丢失情况,在组织病理层面进行探讨。(6)利用原位末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)检测试剂盒对各组大鼠梗死区细胞凋亡进行检测,在组织病理层面进行探讨。(7)分析MSCs-EVs对大鼠MCAO后脑损伤保护作用的相关分子机制及信号通路。(8)数据分析:采用SPSS软件(版本22,IBM,纽约,美国)。数据以均数±标准差表示,数据均使用单因素方差分析(one-way ANOVA)并结合事后分析(post-Bonferroni)进行分析。P<0.05认为差异有统计学意义。2.3实验结果(1)MSCs-EVs对MCAO后大鼠神经功能缺损和脑含水量的影响相比于Sham组,MCAO组大鼠的神经功能缺损评分在24 h和48 h均显著降低(P<0.001),MSCs-EVs的干预可提高MCAO诱导的神经功能缺损评分(24 h:P<0.05,48 h:P<0.01)。MCAO 后 24h大鼠脑水含量明显增加(P<0.001),而MSCs-EVs可显著降低脑水含量(P<0.01)。以上结果表明,MSCs-EVs在CIRI后发挥神经保护作用。(2)MSCs-EVs降低MCAO后的脑梗死体积TTC染色结果显示,梗死区脑组织显示为蜡白色,而正常的脑组织显示为红色。与Sham组相比,MCAO后24h和48 h的脑梗死体积明显增加(P<0.001),而MSCs-EVs显著降低脑梗死体积(P<0.001)。实验结果表明,MSCs-EVs可降低MCAO大鼠CIRI引发的脑梗死的体积并发挥神经保护作用。(3)MSCs-EVs减轻MCAO诱导的神经病理损伤MSCs-EVs可以减轻MCAO后组织病理反应和细胞凋亡率。与Sham组正常皮层神经元清晰的轮廓和均匀的细胞质着色相比,MCAO组中,缺血区皮层细胞受到不同程度的损害。具体表现为神经元萎缩,轮廓模糊,细胞质深染,细胞核与细胞质之间的边界不清晰,尼氏体的数量明显减少。MCAO后24h和48 h TUNEL阳性细胞数量明显增加(P<0.001),而MSCs-EVs的干预可改善MCAO引起的脑组织病理学损伤以及TUNEL阳性细胞的相对数量(P<0.001)。(4)MSCs-EVs提高MCAO后AMPK、JAK2、STAT3的磷酸化水平以及对NF-κB信号传导的影响MCAO后,AMPK通路的关键信号分子活化受到激活,而应用MSCs-EVs后,MCAO组大鼠AMPK的磷酸化水平进一步增高(P<0.001),其下游的JAK2/STAT3通路的关键信号分子活化受到显著抑制(P<0.001),表明,MSCs-EVs的干预可发挥MCAO后抗凋亡及神经保护作用。(5)AMPK信号通路阻断剂(compound C,CC)对MCAO诱导脑损伤神经保护作用的影响在右侧侧脑室内注射AMPK通路特异性阻断剂CC后,MSCs-EVs在MCAO发挥的神经保护作用被一定程度的逆转。结果表明,使用CC阻断AMPK信号通路后,与MSCs-EVs组相比,脑梗死体积可在一定程度上增加(P<0.0 1),梗死皮层中p-AMPK的表达下调(P<0.001)。以上结果证实,MSCs-EVs可通过激活AMPK信号通路来减少CIRI后炎症因子的释放。2.4结论(1)MSCs-EVs可以通过减轻MCAO后大鼠的神经功能缺损、脑水含量、脑梗死体积、组织病理损伤、凋亡细胞相对数量等方式,减轻由MCAO诱导的神经损伤程度,进而改善神经功能。(2)MSCs-EVs发挥MCAO后的神经保护效应的分子机制是通上调AMPK,下调JAK2/STAT3和NF-κB信号通路,从而逆转由MCAO诱导的神经细胞凋亡,进而发挥神经保护作用。