Liguzinediol(2,5-二羟甲基-3,6-二甲基吡嗪),是本课题组经过多年研究筛选得到的一个正性肌力活性化合物,作用靶点为心肌细胞内肌浆网蛋白SRCa2+-ATP酶(SERCAⅡa),具有明确的正性肌力作用,是一种毒性较小,生物利用度高,可用于治疗急性心衰的化合物。课题组前期通过UPLC和LC-MS的方法对liguzinediol在大鼠体内的药代动力学进行了研究,药代动力学参数表明liguzinediol的半衰期较短,且在雌雄大鼠体内有较明显的差异,Liguzinediol在大鼠尿液、胆汁及粪便中原型排泄量低于15%;此外,前期还通过LC-Q/TOF MS的方法在大鼠及犬体内鉴定出许多代谢产物,发现liguzinediol主要代谢途径包括氧化、葡萄糖醛酸结合、半胱氨酸结合和N-乙酰半胱氨酸结合等。为了进一步探讨liguzinediol在大鼠体内代谢处置及物质平衡,本文首先采用了 UPLC法初步研究liguzinediol在大鼠体内的排泄,liguzinediol及主要代谢产物的累计排泄量大于50%。通过进一步分离制备主要代谢产物M4,验证其结构(其余3个主要代谢产物M1、M2、M3由实验室合成所得)。在得到4个主要代谢产物基础上,建立了同时测定血浆中liguzinediol及其主要代谢产物的LC-MS/MS方法,并对其药代动力学进行研究。建立了 LC-MS/MS法对liguzinediol在大鼠尿液、胆汁及粪便的排泄进行研究,从而较为系统地阐明liguzinediol在雌雄大鼠体内的代谢排泄过程,为liguzinediol的进一步开发研究和临床用药提供必要的实验依据。本文主要开展以下几方面的研究:一、UPLC法初步研究liguzinediol在大鼠体内的排泄采用UPLC-PDA法对liguzinediol及其代谢产物在大鼠体内的排泄进行初步研究。12只SD大鼠(雌雄各半),尾静脉注射给药10 mg·kg-1后,按照时间点分别收集尿液、胆汁、粪便;样品经甲醇处理后,离心,取上清液经N2吹干后用流动相复溶。采用UPLC-PDA法对大鼠尿液、胆汁、粪便进行liguzinediol及其代谢产物进行含量测定,并用分子量校正因子(f)折算各物质的含量,计算体内排泄量。结果显示,雌性大鼠在尿液、胆汁、粪便中liguzinediol及其主要代谢产物排泄量分别为47.94%、16.67%、0.65%,雄性大鼠在尿液、胆汁、粪便中liguzinediol及其主要代谢产物排泄量分别为35.00%、20.37%、1.16%。雌雄大鼠累计排泄量均达到55%以上,初步研究了 liguzinediol在大鼠体内的物质平衡,为liguzinediol的临床研究提供实验依据。二、Liguzinediol代谢产物M4的分离鉴定为准确定量描述liguzinediol在体内的代谢处置过程和物质平衡,需制备相关代谢产物的对照品。前期实验发现,尿液中含有较多的乙酰半胱氨酸结合物M4,易于通过分离制备得到。本实验收集尾静脉注射liguzinediol后的大鼠尿样,通过中低压制备液相色谱,C18柱,分离纯化获得代谢产物M4,经HPLC-DAD检测纯度达到98%以上,利用紫外光谱、质谱、核磁共振等光谱信息鉴定M4的结构为liguzinediol的乙酰半胱氨酸结合物。三、Liguzinediol及其代谢产物在大鼠血浆中的药代动力学研究建立快速、灵敏、准确的LC-MS/MS方法同时检测血浆中liguzinediol及其4个主要代谢产物浓度,并对其药代动力学进行研究。血浆样品经甲醇沉淀蛋白并提取,色谱条件采用 Shim-pack XR-ODS 色谱柱(2.0×50 mm,2.2 μm),Shim-pack GVP-ODS 保护柱(2.0×5 mm,4.6 μm);流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸(B)梯度洗脱,运行时间为10min,柱温40℃。质谱条件采用ESI离子源,多反应监测模式(MRM)进行正离子检测,liguzinediol(MO)、M1、M2、M3、M4和内标的选择性检测离子对分别为m/z 169.1→151.0、m/z 272.0→182.6、m/z 183.0→137.0、m/z 345.1→169.1、m/z 314.0→167.0、m/z 188.9→56.0,对原型药和代谢产物进行方法学考察。雌雄大鼠各6只,分别尾静脉注射10 mg·kg-1的liguzinediol,分离血浆,经处理注入液质联用仪分析。结果表明liguzinediol及其4个主要代谢产物的血药浓度在一定范围内呈良好的线性关系,血浆中内源性物质对其测定没有干扰,日内、日间精密度RSD均小于15%,方法回收率、提取回收率、稳定性、基质效应均符合生物样品分析的要求。药动学研究表明liguzinediol的代谢产物的达峰时间(Tmax)均在0.26-1.08 h范围内,M0,M1,M2,M3以及M4在雄性大鼠体内的半衰期(T1/2)分别为(0.34±0.03)h、(1.01±0.23)h、(0.40±0.12)h、(0.66±0.29)h、(1.57±0.60)h;在雌性大鼠体内的半衰期(T1/2)分别为(2.00±0.68)h、(1.82±0.76)h、(1.67±0.36)h、(1.62±0.74)h、(2.96±0.61)h,雄性大鼠的半衰期远小于雌性大鼠的半衰期,雌雄代谢差异较为明显,从原型和代谢产物的药动学参数,可以诠释liguzinediol在大鼠体内的代谢处置过程。四、LC-MS/MS法研究liguzinediol在大鼠体内的排泄建立LC-MS/MS法对liguzinediol在大鼠体内的排泄进行研究。大鼠尾静脉注射给药liguzinediol(10 mg·kg-1)后,通过胆管插管的方式收集不同的时间点的胆汁;通过大鼠代谢笼收集不同的时间点的尿液及粪便。分别建立了大鼠尿液、胆汁及粪便中liguzinediol及主要代谢产物浓度的测定方法,并进行了方法学考察。结果显示雌性大鼠尿液72 h累计排泄量为57.83%,雄性为42.38%;雌性大鼠胆汁24 h内的累计排泄量为17.38%,雄性为11.88%;雌性大鼠粪便72 h内累计排出量为13.59%,雄性为10.58%。liguzinediol主要经大鼠尿液排泄;雌雄大鼠累计排泄基本达到65%,符合物料平衡基本要求。