论文部分内容阅读
匍匐型地被菊作为一类同时具备绿化、美化、彩化和香化综合功能的新奇缺地被植物，在公园与城市绿化上应用前景极为广阔。本研究以本课题组近年选育的匍匐型地被菊品种‘雨花勋章’为试材，建立了其高效再生体系；采用根癌农杆菌介导法对地被菊无菌叶盘进行了菊花来源的DmDREBa基因同源遗传转化研究，优化了其遗传转化体系；对转基因后代逆境胁迫耐性（低温、干旱、高盐）进行了初步鉴定，同时探讨了与胁迫耐性提高有关的生理生化基础。主要研究结果如下：
1.匍匐型地被菊高效再生体系的建立
以匍匐型地被菊品种‘雨花勋章’、‘雨花金桂’和‘雨花银桂’为试材，比较了不同基因型品种叶片离体再生能力，研究了不同激素浓度配比、叶片发育程度、暗培养对‘雨花勋章’叶片再生的影响.结果表明，‘雨花勋章’的再生能力明显高于其他两个品种，其最佳诱导分化培养基为MS+6-BA1.0 mg·l-1+NAA1.0 mg·l-1，再生率达91.1％，平均芽数为7.27，再生芽在1/2 MS+NAA0.1 mg·l-1培养基上生根率达100％，可以满足遗传转化的需要。研究还发现，25d苗龄的无菌苗顶端幼叶为最佳取材时期和部位。分化前期一定时间的暗培养可防止愈伤组织褐变，提高再生率.
2.根癌农杆菌介导的遗传转化体系的建立
以‘雨花勋章’试管苗为试材，对预培养、农杆菌侵染时间、共培养时间、延迟培养时间、诱导物、筛选方式、抑菌方法等与遗传转化相关的参数进行了研究，建立的最优转化体系为：以25d苗龄的无菌苗顶端幼叶作为转化受体，预培养3d，菌液OD600为0.5时侵染10min，25℃黑暗条件共培养3d，延迟培养3d。利用此体系进行了稳定的遗传转化。另外，在共培养基中添加诱导物乙酰丁香酮（AS）会导致外植体褐化加速，不利于转化。‘雨花勋章’对潮霉素十分敏感，10 mg·l-1潮霉素能够完全抑制叶片再生并使其褐死，8 mg·l-1已完全抑制了不定芽生根，在实际研究中，一般确定筛选浓度略低于临界致死浓度，因此，叶盘再生筛选浓度以6～8 mg·l-1为宜，生根筛选浓度以7mg·l-1为宜，在叶盘筛选过程中选用逐步降低选择压，长时间多次筛选的方法，以克服潮霉素对不定芽生长的抑制作用。抑菌抗生素（羧苄青霉素）对‘雨花勋章，叶片再生具有强烈抑制作用，350 mg·l-1羧苄青霉素在有效抑制根癌农杆菌生长的同时也抑制了不定芽的再生，降低到250 mg·l-1时可获得60％的再生率，但抑菌效果不显著，采用逐步降低抑菌素浓度的方法，即在延迟培养阶段使用350mg·l-1彻底脱菌，之后降为250 mg·l-1、150 mg·l-1抑制农杆菌滋生取得了较好效果，有效地提高了转化效率。
3.地被菊抗性芽的筛选、植株再生和检测
抗性愈伤和抗性芽筛选过程中，首先选用延迟筛选的方法将受侵染叶盘在Ms+6-BA1.0 mg·l-1+NAA1.0 mg·l-1+carb350 mg·l-1培养基上延迟培养3d，再转入筛选培养基Ms+6-BA1.0 mg·l-11+NAA1.0 mg·l-1+Hyg8 mg·l-1+carb250 mg·l-1黑暗培养至诱导出抗性愈伤，然后将整个叶盘转入MS+6-BA1.0 mg·l-1+NAA1.0 mg·l-1+Hyg6 mg·l-1+carb150 mg·l-1培养基继续筛选至萌发抗性芽点，切取带有抗性芽点的愈伤块转入零选择压的诱导分化培养基Ms+6-BA1.0 mg·l-1+NAA1.0 mg·l-1使抗性芽恢复生长，待不定芽长到2cm左右时，切取不定芽转入生根筛选培养基1/2Ms+NAA0.1mg·l-1+Hyg7mg·l-1进行生根筛选。将生根筛选获得的部分抗性单株（48株）进行潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）的PCR鉴定，初步获得了28株转基因阳性植株，随机抽取8株进行Southern杂交检测。结果表明，6株PCR阳性植株的目的基因已经整合到地被菊基因组DNA中，并且以2～4个拷贝的形式随机插入。转基因试管苗经过炼苗、移栽，2个月后全部成活。
4.转基因植株对低温、干旱、盐渍逆境胁迫的耐性检测
对6个 Southern杂交鉴定的T0代阳性转基因株系和未转基因植株进行低温胁迫处理，结果显示，6个35S：DmDREBa株系脚芽半致死温度分别为-18.92℃、-19.49℃、-20.22℃、-20.36℃、-20.36℃和-20.57℃，均低于对照-17.43℃.选取差异显著的35S：TDa4和35S：TDa5两个株系进一步进行低温、干旱和高盐耐性分析，结果表明，低温处理后，两个转基因株系的耐低温能力均有不同程度提高，从生理变化上看，过氧化物酶POD活性和脯氨酸（Pro）含量均高于对照，丙二醛（MDA）含量均低于对照，且株系35S：TDa4变化更明显；干旱胁迫下，35S：TDa4和35S：TDa5植株的鲜样质量保持率显著高于对照，存活率分别为43.8％和31.3％，显著高于对照（6.3％），超氧化物歧化酶SOD活性扣脯氨酸（Pro）含量均有所提高，丙二醛（MDA）的含量则均低于对照，表明转基因株系的耐旱能力得到提高；高盐胁迫后，35S：TDa4和35S：TDa5植林存活率分别为50.0％和33.3％，均高于对照（11.1％），同时鲜样质量保持率、过氧化物酶POD活性和脯氨酸（Pro）含量也均较对照提高，丙二醛（MDA）含量则均低于对照。表明转DmDREBa基因阳性地被菊植株的综合抗逆性比对照都有所增强。干旱和高盐处理的材料生长状态一致，数据比较显示，转基因植株对干旱胁迫的响应略高于对高盐胁迫的响应。