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目的:本研究探讨MPTP诱导的亚急性PD动物模型的系统行为学、肠道菌群和纹状体神经递质的变化特点,以及不同配穴电针刺激对PD小鼠运动行为、肠道菌群多样性、纹状体神经递质水平的影响作用,以建立系统、高效、准确的判断PD及PD早期疗效评价的行为学指标体系,探究肠道菌群多样性和PD发病的关系,明确电针头部穴位（百会、大椎穴）与电针四肢穴位（合谷、太冲）对PD小鼠的干预作用特点,从而为临床电针治疗PD提供新的思路和实验依据。方法:1.通过应用MPTP（30mg/kg）连续7天经腹腔注射制作小鼠帕金森动物模型,造模结束后即开始检测爬杆、转棒和悬挂行为指标,采用传统的动物行为学检测方法评价帕金森动物模型是否建立。2.建立模型成功后给予各组相应干预措施,对照组、模型组正常饮食;模型+阳性药（美多芭）组美多芭灌胃给药,按临床人体给药剂量折算,6.25mg/kg小鼠体重,每天一次,连续2周;模型+电针头部穴位组（百会、大椎穴）电针干预,连续2周;模型+电针四肢穴位组（合谷、太冲穴）电针干预,连续2周。连续电针1周、2周时动态检测系统评价各组小鼠步态、爬杆、转棒和悬挂行为指标的变化。3.PD动物在完成干预治疗2周结束行为学测试后,腹腔注射1%戊巴比妥钠,按35mg/kg体重进行麻醉,麻醉后取材,分离大脑,取双侧纹状体,并采用酶联免疫吸附测定纹状体多巴胺、乙酰胆碱水平,观察不同配穴电针透刺对PD小鼠神经递质的影响。4.PD动物在完成干预治疗2周结束行为学测试后,麻醉取双侧纹状体同时,截取实验小鼠的结肠组织对肠道菌群进行分类学、多样性、群落组成及物种差异分析,明确PD动物肠道菌群多样性特点及电针干预后的影响。结果:1.帕金森动物模型的建立及其行为学特点分析1.1 PD小鼠一般行为学观察结果小鼠在注射MPTP 5-30min后,出现竖毛、震颤、翘尾、后背上弓、后肢张开等躁动不安的症状,30min后出现流涎现象,1h后开始活动减少,目光呆滞,反应迟钝,运动变慢。2h后上述症状逐渐消失,6小时后基本恢复正常。随着给药次数的增加,活动减少、运动变慢、反应迟钝的表现越来越明显。1.2 PD小鼠爬杆实验测定结果小鼠腹腔注射MPTP连续7天后,进行爬杆行为测试,结果发现,与对照组比较,模型组小鼠在测试杆上半部分时间、下半部分时间及总时间（上半部分时间与下半部分时间之和）具有不同程度的延长（P<0.01,P<0.001,P<0.001）。1.3 PD小鼠悬挂实验测定结果悬挂测试中将C57BL/6小鼠后爪抓住电线的情况,按照评分标准,进行打分,分值越高,小鼠抓住电线越牢固;说明小鼠肢体运动协调情况越好,反之,则说明小鼠震颤、肌强直等情况严重。结果发现对照组和PD模型组的分值组间有显著性差异（P<0.05）。另外,与对照组相比,模型组的掉落潜伏期显著降低（P<0.01）。1.4 PD小鼠转棒实验测定结果为了研究腹腔注射MPTP后对小鼠运动能力的影响,本实验另外还采用转棒法来检测PD小鼠运动的平衡和协调能力。在评价啮齿类动物的运动协调能力时,转棒实验是最常用的方法,实验前对小鼠进行转棒实验训练1周,结果发现MPTP末次注射7天后,小鼠在转棒上的停留时间（潜伏期）明显缩短（P<0.05）。以上PD模型小鼠的行为学结果均符合帕金森疾病的症状特征。2.不同电针取穴对帕金森病动物模型行为改善作用2.1电针刺激1周各组小鼠行为学实验测定结果2.1.1电针刺激1周各组小鼠步态行为实验测定结果本结果发现帕金森病动物模型平均体转角、单支撑时相、双支撑时相、足迹平均强度、对侧协调性、速度、步行周期、支撑时相、瞬时速度、推进指数均有显著的异常变化,电针头部穴位、四肢穴位以及阳性药美多芭治疗1周后步态功能均有明显的改善,尤其电针刺激四肢穴位治疗后步态指标的改善个数及改善程度明显优于电针头部穴位组。2.1.2电针刺激1周各组小鼠爬杆行为实验测定结果电针刺激1周时,模型组与对照组比较,爬杆实验下半部分时间、爬杆总时间明显延长（P<0.01,P<0.01）,与模型组比较,阳性药组、电针头部穴位组、电针四肢穴位组未见有明显改善。2.1.3电针刺激1周各组小鼠悬挂行为实验测定结果电针刺激1周时,与对照组比较,模型组掉落潜伏期与悬挂得分明显减少（P<0.05,P<0.01）;与模型组比较,电针头部穴位组、电针四肢穴位组、阳性药组小鼠掉落潜伏期与悬挂得分均未见有明显变化。2.1.4电针刺激1周各组小鼠转棒行为实验测定结果电针刺激1周与对照组比较,模型组潜伏期明显缩短（P<0.05）,与模型组比较,电针头部穴位组、电针四肢穴位组、阳性药组小鼠潜伏期均未见有明显变化。2.2电针刺激2周各组小鼠行为学实验测定结果2.2.1电针刺激2周各组小鼠步态行为实验测定结果本结果发现帕金森病动物模型平均体转角、单支持时向左后、单支持时向右后、双支持时向左前右后、双支持时向左后右前、左前足迹平均面积、左后足迹平均面积、右前足迹平均面积、右后足迹平均面积、左前足迹平均强度、右前足迹平均强度、左后足迹平均强度、右后足迹平均强度、右后相对于左前对侧协调性、右前相对于左后对侧协调性、速度、平均步行周期、支撑时相左前、支撑时相左后、支撑时相右前、支撑时相右后、瞬时速度左前、瞬时速度左后、瞬时速度右前、瞬时速度右后均有显著的异常变化,说明帕金森病动物模型造模后2周步态发生了明显的功能障碍,电针头部穴位、四肢穴位以及阳性药美多芭治疗2周后步态功能均有明显的改善,尤其电针头部穴位治疗后步态指标的改善个数及改善程度明显优于电针四肢穴位组。2.2.2电针刺激2周各组小鼠爬杆行为实验测定结果电针刺激2周时,模型组与对照组比较,爬杆实验掉头时间、上半部分时间、下半部分时间、爬杆总时间明显延长（P<0.001,P<0.01,P<0.001,P<0.01）,与模型组比较,电针头部穴位组掉头时间、上半部分时间、爬杆总时间明显缩短（P<0.05,P<0.05,P<0.05）,电针四肢穴位组上半部分时间、下半部分时间明显缩短（P<0.05,P<0.05）,阳性药组掉头时间、下半部分时间明显缩短（P<0.05,P<0.05）。2.2.3电针刺激2周各组小鼠悬挂行为实验测定结果电针刺激2周,与对照组比较,模型组掉落潜伏期明显缩短（P<0.01）,与模型组比较,电针头部穴位组、电针四肢穴位组、阳性药组小鼠掉落潜伏期均明显延长（P<0.05,P<0.01,P<0.05）;与对照组比较,模型组悬挂实验得分明显减少（P<0.05）,与模型组比较,电针头部穴位组、阳性药组小鼠悬挂实验得分明显增加（P<0.05,P<0.05）。2.2.4电针刺激2周各组小鼠转棒行为实验测定结果电针刺激2周与对照组比较,模型组潜伏期明显缩短（P<0.01）,与模型组比较,电针头部穴位组小鼠潜伏期明显延长（P<0.05）。3.不同电针取穴对帕金森病动物脑组织神经递质水平的影响3.1电针治疗对帕金森小鼠脑组织纹状体中多巴胺水平的影响模型组小鼠纹状体多巴胺水平与对照组比较明显降低（P<0.001）,与模型组比较,电针头部穴位组、电针四肢穴位组与阳性药组多巴胺水平有明显的增加（P<0.001,P<0.05,P<0.001）。3.2电针治疗对帕金森小鼠脑组织纹状体中乙酰胆碱水平的影响模型组小鼠纹状体乙酰胆碱水平与对照组比较明显降低（P<0.01）,与模型组比较,电针头部穴位组、电针四肢穴位组与阳性药组乙酰胆碱水平有明显的增加（P<0.05,P<0.05,P<0.05）。4.不同电针取穴对帕金森病动物肠道菌群的影响4.1肠道菌群的分类学分析结果肠道菌群的Rank-Abundance曲线图显示:对照组小鼠的曲线宽度小、在横轴上的范围小;模型组小鼠的Rank-Abundance曲线的宽度大、在横轴上的范围大;而电针组小鼠的Rank-Abundance曲线介于对照组和模型组之间。4.2 Pan/Core物种分析结果肠道菌群的Pan曲线图显示:三组小鼠的肠道菌群OTU数目随样本数增加而增加,当每组样本数量增加到4的时候,OTU数目的增加趋于平缓,说明每组的样本数量充足。此外,模型组的总OTU数量最多,电针四肢穴位组次之,对照组较少。肠道菌群的Core曲线图显示:三组小鼠的肠道菌群共有OTU数目随样本数增加而降低,当每组样本数量增加到5的时候,OTU数目的降低趋势趋于平缓,说明每组的样本数量充足。此外,每组样本量达到6时,模型共有OTU数量最多,对照组次之,电针四肢穴位组最少。4.3肠道菌群的α多样性分析群落丰富度的指数分析结果显示:与对照组比较,模型组小鼠肠道菌群的ace、chao和sobs指数均有上升,但其差异不具有统计学意义（P>0.05）,电针四肢穴位组组与模型组无显著性差异（P>0.05）;与模型组相比较,电针四肢穴位组组具有一定程度的下降,但无显著性差异（P>0.05）。群落多样性的指数分析结果显示:与对照组比较,模型组和电针组小鼠肠道菌群的shannon有一定程度的上升,simpson指数有明显的下降,但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。4.4肠道菌群的Beta多样性分析选取了矩阵特征值排在前两位的坐标数据（PC1和PC2）进行主成分分析（principal component analysis,PCA）,结果显示:在OTU分类水平上,模型组与对照组样本所处区域不同,分界较为清楚,相互距离较远,而电针组与模型组所处区域有重叠,分界不清,组间距离较近,但电针四肢穴位组与对照组之间的距离较模型组与对照组之间的距离近。基于排在前几位的距离矩阵特征值进行主坐标分析（principal co-ordinates analysis,PCo A）,结果显示:在OTU分类水平上,对照组与模型组、电针四肢穴位组组三组的各样本的平面分布区域不同,分界较为清楚,相互距离较远;电针四肢穴位组样本分布范围较模型组离正常组近。在OTU分类水平上进行非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling,NMDS）,结果表明:对照组各样本分布比较集中,其他两组与对照组的空间距离较远,以模型组最远;模型组和电针四肢穴位组分布区域有重叠。4.5肠道微生物群落组成分析在门（phylum）分类水平下,对肠道菌群的群落结构进行分析,结果显示:检测到的菌群类别中,与对照组比较,模型组小鼠的厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（actinobacteria）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）和疣微菌门（Verrucomicrobia）所占比例有明显升高,拟杆菌门（Bacteroidetes）所占比例降低;与模型组比较,电针四肢穴位组小鼠的厚壁菌门（Firmicutes）,放线菌门（actinobacteria）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）和疣微菌门（Verrucomicrobia）所占比例有下降,拟杆菌门（Bacteroidetes）所占比例有上升。4.6肠道菌群的物种差异分析选择属分类水平下,群落丰度排在前15的肠道菌群进行组间差异显著性检验,结果显示:norankf<sub>BacteroidalesS24-7group、Lactobacillus、Alistipes、Turicibacter、Faecalibaculum、LachnospiraceaeNK4A136group、LachnospiraceaeNK4A136group、Bifidobacterium、CoriobacteriaceaeUCG-002、Clostridiumsensustricto1、unclassifiedf<sub>Erysipelotrichaceae、PrevotellaceaeUCG-001、DefluviitaleaceaeUCG-011、unclassifiedo<sub>Bacteroidales、unclassifiedf<sub>Peptostreptococcaceae、Burkholderia-Paraburkholderia共15类菌存在组间显著性差异（P<0.05或P<0.01）。其中,与对照组相比,帕金森模型组CoriobacteriaceaeUCG-002和Clostridiumsensustricto1显著升高（P<0.05或P<0.01）,而电针四肢穴位组可显著降低其水平（P<0.05或P<0.01）。与对照组相比,帕金森模型组Turicibacter、DefluviitaleaceaeUCG-011和unclassifiedo<sub>Bacteroidales均有显著性变化（P<0.05或P<0.01）,电针四肢穴位组有一定的改善作用,但未见统计学差异。结论:1.电针头部穴位（百会、大椎穴）和电针四肢穴位（合谷、太冲穴）均能有效改善PD模型小鼠的运动功能障碍,对与PD密切相关的神经递质也有明显的改善作用;且电针头部穴位和电针四肢穴位治疗PD各有优势,为临床电针治疗PD提供新的思路和实验依据。2.全自动步态分析系统克服了传统经典的行为评价方法早期无法准确敏感地捕捉到帕金森病动物行为细微变化的缺点,且最大限度地降低了对实验动物的损伤和刺激,可能可以取代或部分取代目前帕金森动物实验经典的行为评价手段,成为一个更加客观全面,高效准确的新方法,为探索评价针灸治疗帕金森病提供新方法。3.MPTP诱导的PD模型小鼠存在肠道菌群的多样改变,电针能够促进PD模型小鼠肠道菌群多样性异常变化的恢复,初步证实了肠道菌群的多样性和PD的发病密切相关,且电针可能通过调节肠道菌群多样性从而缓解PD小鼠的运动功能障碍。