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研究背景与目的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经系统退行性疾病,平均发病年龄60岁,60岁以上发病率约1%,全球已有超500万患者。PD的主要临床症状有静止性震颤、运动迟缓、肌强直、步态和姿势平衡障碍等,发病后期可致残。PD的主要病理改变是中脑黑质部中多巴胺(DA)能神经元死亡。PD是由多种因素引起的疾病,它与遗传因素、环境因素、年龄、线粒体、自噬等相关,但其具体的病因及其机制目前还未完全明确,有待深入研究。目前临床上仍然没有有效的方法进行PD的早期诊断,因此研究PD的发病机制对于PD的诊断和治疗是至关重要的。炎症参与了PD的发病,而胶质细胞的组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)参与了神经系统炎症的发生发展,所以CTSB可能参与PD的发生发展。MicroRNAs(miRNAs)是一种内源性的长度21-23个核苷酸单链小分子RNA,它通过与靶基因信使RNA(mRNA)的3′非翻译区(3′UTR)结合诱导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译,对真核细胞的基因表达、细胞发育分化和个体发育等多方面起调控作用。有研究发现PD患者血清中miR-214-3p的量显著下调,但是miR-214-3p在PD发生发展中的调控作用有待进一步阐明,其对PD发病机制的研究以及治疗方法的创新具有重要意义。通过生物信息学分析发现CTSB基因可能是miR-214-3p的靶基因,而miR-214-3p调控CTSB蛋白与PD是否相关国内外鲜有报道。本研究以BV2细胞和U87MG细胞作为小胶质细胞与星形胶质细胞的代表,SH-SY5Y细胞是研究PD常用的细胞模型,再将miR-214-3p导入胶质细胞,以探索miR-214-3p是否调控胶质细胞CTSB蛋白降低多巴胺能神经元活力。本课题组在胶质细胞中过表达miR-214-3p,再使用药物1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP~+)刺激,观察CTSB表达与miR-214-3p的变化情况,最后收集胶质细胞的条件培养基(CM)去培养多巴胺能神经元,检测多巴胺能神经元活力。本项研究将阐明miR-214-3p调控胶质细胞CTSB蛋白对多巴胺能神经元活力的影响,为PD的临床治疗提供一定的实验支持。材料与方法第一部分mi R-214-3p可结合CTSB mRNA的3′UTR1.重组GP-miRGLO-CTSB野生型质粒和GP-miRGLO-CTSB突变型质粒。2.CTSB的野生型质粒和突变型质粒分别与miR-214-3p的Mimics、NC、Inhibitor及Inhibitor NC共转染HEK293T细胞进行荧光素酶报告基因实验。3.将不同剂量的miR-214-3p Mimics与相同剂量的野生型质粒共转染HEK293T细胞进行荧光素酶报告基因实验。4.统计学分析:所有数据均由SPSS21.0统计软件处理,定量资料应用均数±标准差(Mean±SD)表示;多组均数的比较使用单因素方差分析(ONE ANOVA),并利用LSD-t法进行组间比较;以α=0.05为显著性检验水准。第二部分mi R-214-3p调控胶质细胞(小胶质细胞和星形胶质细胞)CTSB蛋白影响多巴胺能神经元活力的研究1.miR-214-3p的Mimics、NC、Inhibitor及Inhibitor NC分别转染BV2细胞和U87MG细胞后,内源性蛋白进行Western Blotting。2.MPP~+单独刺激BV2细胞和U87MG细胞后利用Western Blotting和qRT-PCR分别检测蛋白和RNA的变化。3.miR-214-3p与MPP~+共同作用BV2细胞和U87MG细胞后,用Western Blotting和qRT-PCR检测蛋白和RNA的变化。4.miR-214-3p与MPP~+共同作用BV2细胞和U87MG细胞后,分别收取CM培养SH-SY5Y细胞,再利用化学发光法进行细胞活力检测。5.统计学分析:所有数据均由SPSS21.0统计软件处理,定量资料应用均数±标准差(Mean±SD)表示;多组均数的比较使用单因素方差分析(ONE ANOVA),并利用LSD-t法进行组间比较;以α=0.05为显著性检验水准。结果1.验证了CTSB是miR-214-3p的靶基因。2.miR-214-3p以浓度依赖的方式调控CTSB表达。3.与miR-214-3p的NC、Inhibitor、Inhibitor NC相比miR-214-3p Mimics能够下调BV2细胞和U87MG细胞中的CTSB蛋白(P﹤0.05)。4.MPP~+单独刺激分别使BV2细胞和U87MG细胞中的CTSB蛋白水平显著升高,但对CTSB的mRNA水平影响不明显,只有BV2细胞的miR-214-3p表达水平明显下降。5.miR-214-3p与MPP~+共同作用BV2细胞和U87MG细胞,miR-214-3p能逆转MPP~+引起上调的CTSB蛋白,但CTSB的mRNA无显著性变化。6.miR-214-3p与MPP~+共同作用BV2细胞和U87MG细胞,两种细胞的CM都能降低SH-SY5Y细胞活力。结论1.miR-214-3p能够调控胶质细胞中CTSB基因的表达。2.MPP~+能够使胶质细胞中的CTSB蛋白表达升高。3.静息或激活的胶质细胞内过表达miR-214-3p得到的条件培养基均使多巴胺能神经元活力明显下降。