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产毛性能是长毛兔的重要经济性状,寻找与长毛兔产毛相关的遗传标记是长毛兔育种的基础工作。角蛋白17(Keratin 17,KRT17)是角蛋白基因家族的一员,在毛囊发育与毛发生长过程中发挥作用。本研究从分子遗传学与表观遗传学角度,以皖系长毛兔为研究对象,探究KRT17的遗传变异与DNA甲基化修饰对产毛性能的影响,筛选与产毛性能显著相关的SNP位点和DNA甲基化位点。再结合KRT17基因表达信息,探究遗传标记位点对KRT17基因mRNA表达的影响,并深入解析转录因子SP1对KRT17表达调控的相关机制,为长毛兔的遗传育种提供理论支持与分子依据。试验结果如下:1.为了寻找KRT17基因上潜在的遗传标记位点,收集了 217只长毛兔个体的有效生产数据,根据群体均值1.5个标准差的标准,筛选高产毛组和低产毛组。设计特异性引物,采用RACE和克隆技术获得KRT17基因的全长序列,共1608 bp,包括72 bp的5’UTR、1299bp的开放阅读框、237 bp的3’UTR。绘制KRT17基因结构图,包括8个外显子、7个内含子。对启动子区、外显子和内含子进行PCR扩增与测序,结果均未检测到SNP位点,表明KRT17基因结构相对保守。2.进一步分析KRT17基因生物学功能,利用实时荧光定量技术检测长毛兔不同组织中的mRNA表达量,发现KRT17基因在皮肤组织中表达量显著高于其它组织(P<0.01);在不同毛囊发育时期中,KRT17基因均有表达,在150天时表达量最高(P<0.01);在高产毛组中,KRT17表达量显著高于低产毛组(P<0.01)。通过siRNA干扰和过表达试验,发现KRT17基因过表达或敲低时,均可以影响WNT2、FGF2等毛囊发育相关基因的mRNA表达量,提示KRT17与毛囊发育密切相关。3.为探究KRT17启动子甲基化与产毛量的关联性,利用高、低产毛组皮肤组织DNA样品,通过亚硫酸氢盐处理后测序PCR(BSP)检测KRT17启动子3个CpG岛的甲基化模式,结果显示,CpG Ⅰ和CpG Ⅲ整体甲基化水平较高,CpG Ⅱ整体甲基化水平较低,同时发现CpG Ⅰ和CpG Ⅲ整体的高甲基化与低产毛量显著相关(P<0.05),同时筛选到5个CpG位点(CpG Ⅰ中CpG4、CpG Ⅲ中CpG2～5)的甲基化水平在高、低产毛组差异显著(P<0.05)。进一步探究KRT17基因甲基化修饰对mRNA表达的影响,结果发现CpGⅠ和CpGⅢ整体甲基化水平与mRNA表达呈负相关,但没有显著差异(P>0.05)。同时发现3个CpG位点(CpG Ⅰ中CpG4、CpG Ⅲ中CpG4和14)的甲基化水平与基因表达显著相关(P<0.05)。综合考虑CpG Ⅲ的CpG4位点既与产毛量显著相关,又与基因表达显著相关,可以作为提高长毛兔产毛量的候选表观遗传标记。4.为进一步揭示转录因子 SP1(Transcription specificity protein 1)对KRT17转录的调控机制,对SP1进行过表达/干扰,发现SP1可以显著上调/下调KRT17基因表达(P<0.05)。构建KRT17启动子序列缺失载体,荧光素酶报告基因结果表明,启动子活性区域为-1395～-470 bp。对SP1结合位点进行点突变,结合SP1过表达载体与双荧光素酶报告基因载体共转染,结果发现SP1可以显著提高KRT17启动子活性(P<0.05);EMSA结果表明,SP1蛋白可以与KRT17启动子序列特异性结合,结合位点为CGCTACGCCC。以上试验说明,SP1可以与KRT17启动子区特异结合,正调控KRT17启动子活性,导致基因表达上调。