端部游离氨基酸去除对普鲁兰酶酶学性质的影响

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普鲁兰酶是一种能够专一性水解α-1,6糖苷键的淀粉脱支酶,属于糖苷水解酶GH13家族、GH57家族。目前,它已被广泛的应用到饲料、酿酒、医药等相关的各个领域。然而因为技术的局限,中国目前尚无具有自主产权的普鲁兰酶。本课题组前期从淀粉厂附近的土壤中筛到一株普鲁兰酶的高产菌株Klebiella variicola strain 7,克隆获得基因后在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达。但是胞内表达量较低,同时该酶的稳定性不好不能达到工业生产需要。本研究利用基因工程的手段实现了普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的异源表达,同时对普鲁兰酶进行端部游离氨基酸的去除以期望提高该酶的稳定性。实验结果如下:1.普鲁兰酶在芽孢杆菌中的表达设计一对引物XbaⅠ-F1、AatⅡ-R1,以前期获得的pET21a-pluA-signal质粒为模板进行PCR,克隆得到去信号肽的普鲁兰酶基因pluA。将pluA基因用限制性内切酶XbaI、AatⅡ进行双酶切,与同样进行双酶切的pHT43载体进行酶连反应。将酶连产物导入克隆宿主大肠杆菌JM109中获得阳性转化子,提取重组质粒pHT43-pluA,然后将重组质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中,检测胞外酶活为0.6 U/mL。2.去除普鲁兰酶端部游离氨基酸本课题通过生物信息学方法对来自菌株Klebiella variicola strain 7野生型普鲁兰酶的二级、三级结构进行分析,发现N端和C端分别存在35个游离氨基酸和3个游离氨基酸均形成无规则的结构,推测对普鲁兰酶的稳定性具有不利影响。因此,我们通过基因工程技术分别去除这些氨基酸,得到5个突变体并分别对其进行酶学性质检测。突变体酶学性质测定如下:(1)pluA-N31最适pH为由6.0降低到5.6,其他突变体最适pH均无变化。(2)pluA-N35最适温度由45℃提高到48℃,其他突变体最适温度均无变化;各个突变体的半衰期均得到较大的提高,pluA-N31、pluA-N35和pluA-C3的半衰期分别是野生型酶pluA的6.17倍、5倍、4.16倍,pluA-N4、pluA-N4-C3的半衰期均是野生型的1.66倍。(3)pluA-N31、pluA-N35的比酶活分别是野生型的1.6倍、1.06倍,其他突变体比酶活都有所下降。(4)pluA-N31、pluA-N4、pluA-N35、pluA-C3、pluA-N4-C3的Km值分别是野生型pluA的0.45倍、1.49倍、1.31倍、1.35倍、1.32倍;pluA-N31、pluA-N4、pluA-N35、pluA-C3、pluA-N4-C3的Kcat值分别是原来的0.83倍、0.67倍、1.1倍、0.38倍、0.92倍。由此可知:去除普鲁兰酶二级结构中无规则片段对提高普鲁兰酶的热稳定性具有正向作用。
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