【摘 要】
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目的:探讨外周血CD34+细胞B2受体及自噬在冠脉造影阴性的糖尿病患者中的表达水平。方法:收集冠脉造影阴性的糖尿病患者外周血,冠脉造影阴性的非糖尿病患者作为对照组。取得病人同意并签署知情同意书,收集5ml外周血样品,使用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,单个核细胞分别与FITC标记的CD34抗体+兔抗人B2R抗体、CD34抗体+兔抗人P53蛋白抗体、CD34抗体+兔抗人LC3B孵育1小时,与PE标记
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目的:探讨外周血CD34+细胞B2受体及自噬在冠脉造影阴性的糖尿病患者中的表达水平。方法:收集冠脉造影阴性的糖尿病患者外周血,冠脉造影阴性的非糖尿病患者作为对照组。取得病人同意并签署知情同意书,收集5ml外周血样品,使用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,单个核细胞分别与FITC标记的CD34抗体+兔抗人B2R抗体、CD34抗体+兔抗人P53蛋白抗体、CD34抗体+兔抗人LC3B孵育1小时,与PE标记的二抗1ul孵育1小时。洗涤后使用流式细胞仪进行分析。结果:研究表明,在冠脉造影阴性的病人中,糖尿病患者与非糖尿病患者的CD34+表达未见明显差异（0.2985±0.14597 vs 0.3235±0.6235,P>0.05）,CD34+细胞在总人群中表达的比例在0.13%～0.66%（中位数:0.28%）。在冠脉造影阴性的患者循环CD34+细胞上,糖尿病患者的B2R表达低于非糖尿病患者（n=20,P<0.05,0.2725±0.11238 vs 0.5105±0.12305）,LC3B的表达高于非糖尿病患者（n=20,P<0.05,0.3060±0.08935 vs 0.1445±0.10247）。结论:在冠脉造影阴性的患者中,糖尿病患者外周血CD34+细胞中,B2R的表达低于非糖尿病患者,LC3B的表达高于非糖尿病患者。目的:探讨过氧化氢环境下,缓激肽调节内皮祖细胞自噬的机制。方法:取小鼠下肢骨髓,使用EGM-2MV培养基培养获取内皮祖细胞。使用过氧化氢处理内皮祖细胞,并使用不同浓度的缓激肽干预细胞,使用荧光定量PCR、免疫印迹检测B2R、AKT、p-AKT及P53的表达;荧光检测试纸盒和免疫印迹测LC3B。再分别使用B2R拮抗剂、PI3K拮抗剂、m TOR拮抗剂,检测不同信号通路阻断剂对BK作用的影响,上述方法检测B2R、AKT、P-AKT及P53、LC3B的表达。结果:过氧化氢处理内皮祖细胞后,通过Western Blot、q PCR证实过氧化氢抑制了B2R、p-AKT的表达（n=3,P<0.05对照组vs H2O2）。Western Blot、免疫荧光提示过氧化氢环境下LC3B及P53的表达升高。使用不同缓激肽预处理后,Western Blot、q PCR显示B2R、p-AKT表达较过氧化氢组表达增强（n=3,P<0.05 H2O2vs BK+H2O2）,Western Blot及免疫荧光显示LC3B、P53表达较过氧化氢组减弱（n=3,P<0.05 H2O2vs BK+H2O2）。其中0.1n M BK较1n M BK、10n M BK抑制作用明显,有统计学差异（n=3,P<0.05 0.1n M BK vs 1n M BK+H2O2vs 10n M BK+H2O2）。上述结果表明:过氧化氢抑制B2R、p-AKT的表达,促进LC3B、P53的表达。BK部分逆转了这一结果,促进过氧化氢环境下B2R、p-AKT的表达,抑制LC3B、P53的表达。与对照组相比,HOE-140、LY294002、雷帕霉素显著抑制BK对过氧化氢环境下内皮祖细胞自噬的保护作用。与BK预处理的内皮祖细胞相比,加入信号通路抑制剂后,Western Blot显示B2R、p-AKT表达下降,LC3B及P53表达增加（n=3,P<0.05BK+H2O2vs BK+H2O2+HOE140;P<0.05 BK+H2O2vs BK+H2O2+RAPA;BK+H2O2vs BK+H2O2+LY294002）,阻断了BK的保护作用。q PCR显示B2R表达下降,P53表达增加（n=3,P<0.05 BK+H2O2vs BK+H2O2+HOE140;P<0.05 BK+H2O2vs BK+H2O2+RAPA;P<0.05 BK+H2O2vs BK+H2O2+LY294002）。免疫荧光提示使用HOE140、RAPA及LY294002阻断信号通路后,LC3B表达增加。综上,信号通路抑制剂促进了BK在过氧化氢环境下B2R的表达,抑制了LC3B的表达。结论:过氧化氢抑制内皮祖细胞B2R的表达,促进自噬及P53的表达。BK保护过氧化氢环境下B2R及LC3B的表达,促进B2R的表达,抑制了自噬及P53的表达。BK通过B2R/PI3K/AKT/m TOR信号通路调节细胞自噬及P53的表达。
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