论文部分内容阅读
动物乳腺生物反应器作为一种生产重组蛋白的技术,在批量化生产重组蛋白方面具有重要应用价值,然而,利用基因编辑技术将外源基因整合到动物基因组中,转基因动物乳汁中重组蛋白的表达量始终处于较低水平。而CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9)系统凭借设计的简便性、编辑的高效性迅速被应用于众多科研领域,本研究利用CRISPR/Cas9系统设计奶山羊胎儿成纤维细胞CSN2基因敲除载体,筛选出高效敲除效率的sgRNA及突变细胞株,为敲除CSN2基因奶山羊的制备提供原始材料;同时,使用双载体转染法,研究CRISPR/Cas9系统在奶山羊胎儿成纤维细胞CSN2基因大片段敲除上的有效性,最后,利用载体特异性,按照不同标签载体组合共转细胞,筛选出最高阳性细胞比例获得方案,研究结果如下:1.在奶山羊胎儿成纤维细胞CSN2基因第二、第八外显子处设计并成功构建5个sgRNA敲除载体(sgRNA T1、sgRNA T2、sgRNA T3、sgRNA E1和sgRNA E2);使用T7EI酶切鉴定,sgRNA T1和sgRNA E2敲除效率最高为34.9%和25.9%;最终成功获得两株CSN2基因突变细胞系。2.优化奶山羊胎儿成纤维F4代细胞转染条件,细胞生长密度达80~90%,按照5μgPX330-eGFP质粒与10μl lipofectamine 2000转染细胞,转染时间为6h时,细胞转染效率达到最高为24.3%。3.将重组质粒eGFP-sgRNA T1和Neo-sgRNA E2、eGFP-sgRNA T1和eGFP-sgRNA E2分别共转染奶山羊胎儿成纤维细胞,单克隆测序结果表明敲除长度最长达7760bp;T7EI酶切鉴定,其敲除效率最高达16.2%;经荧光定量PCR及细胞免疫荧光检测,结果表明eGFP+Neo组能获得较高长片段突变细胞比例(P<0.05)。