研究背景和目的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是临床常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内呈现高发趋势。研究表明,HCC的形成是由多种因素参与多个步骤协同所致。而在我国,乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)的感染是导致肝癌发生、发展的主要原因之一。乙肝病毒X基因所编码的X蛋白(Hepatitis B virusx protein,HBx)是HBV复制过程中的功能蛋白。现今的多项研究表明,HBx可通过蛋白-蛋白相互作用,影响细胞内信号通路、转录因子调控等关键细胞生理功能而起到诱发癌症发生的关键作用,在HBV诱发的HCC的癌变进程中发挥着不可忽视的作用。而肝脏作为人体最大的代谢器官,可代谢清除体内的各种内、外源性物质,保护机体,维持机体稳态。在肝脏中发挥主要代谢作用的药物代谢酶在机体内具有非常重要的生理功能。其含量最为丰富,功能最为突出的Ⅰ相药物代谢酶细胞色素CYP450代谢酶(Cytochrome P450s,CYP450)就是机体维持自身稳态,清除外源化学致癌物的关键酶系,亦是机体实现自我保护和应激防御的重要屏障。作为CYP450家族中的主要亚型,CYP3A4也是肝脏中表达最丰富的药物代谢酶,参与了近50%外源物质和30%内源物质的代谢过程。其参与肝脏首过效应,可将前提药物代谢成为活性药物;也可使药物毒性减弱,同时改变药物代谢产物极性,使其利于排出体外。因此,药物代谢酶在体内的表达及功能活性是否正常直接关系到机体的正常生理功能和健康状况。研究表明,在肝脏发生疾病时,例如非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)、肝硬化(Hepatic cirrhosis)的发生均会致使肝脏中药物代谢酶功能发生改变。这种功能的改变通常是通过改变药物代谢酶的基因转录从而降低了药物代谢酶的表达量。而由于药物代谢酶的功能受损,其代谢清除机体有害物质的能力降低,又进一步损伤机体,促进疾病的的发展进程。在由HBV诱发HCC的过程中,药物代谢酶的表达同样受到抑制,但是药物代谢酶、HBx、HCC三者之间的相互作用关系尚不明确。药物代谢功能的降低究竟是由于HCC发生而最终引起的功能改变,还是其本身功能的改变就是HCC发生发展的诱因之一尚不十分清楚。药物代谢酶能否成为抑制HBV诱发HCC发生发展或有效控制、治疗HCC的新靶标尚有待研究。研究方法本研究选取临床确诊具有HBV感染背景的HCC患者的临床肿瘤样本,通过基因芯片技术,筛选出HCC肿瘤组织中与HBx蛋白相关性最大的药物代谢酶系。通过基因芯片筛选出的CYP3A4以及pathwany关联分析得到的RAS-Raf-MEK-ERK信号通路在临床HCC病例中均有较高的表达和指证。针对CYP3A4、HBx和HCC三者之间的相互关系,通过建立体外细胞瞬时转染模型,将构建的重组人源HBx和CYP3A4质粒体分别转染进入HepG2、HepG2.2.15和Huh-7细胞系中,探明HBx对RAS-Raf-MEK-ERK信号通路的诱导作用,以及CYP3A4对HBx诱导RAS-Raf-MEK-ERK信号通路的抑制作用。同时,选用正常肝细胞系L02,建立HBx浓度依赖型细胞瞬时转染模型,模拟体外HBx诱发正常细胞向肿瘤细胞转化过程。在正常细胞向肿瘤细胞转化的过程中,动态监控HBx对RAS-Raf-MEK-ERK信号通路的诱导作用,以及CYP3A4对此诱导作用的抑制。初步探索CYP3A4对HBx在诱发正常肝细胞癌变的动态过程中,以及诱发肿瘤细胞恶性程度增高等相关作用的干预作用及机制。研究结果选取临床具有明确诊断且HBV感染背景在5年以上的HCC患者,收集患者肿瘤组织,提取组织的基因样本进行标记,随后对肝脏中表达丰富或有特殊功能作用的药物代谢酶以及和肿瘤密切相关的信号转导通路进行检测。通过对检测结果进行聚类、关联等分析,筛选出HCC发生后肿瘤组织与癌旁正常组织中改变最大的药物代谢酶CYP3A4,相比于癌旁正常组织,HCC肿瘤组织中CYP3A4平均降低了 27.09倍。通过对诸多肿瘤相关的pathway的关联分析以及相关性检验,筛选出与HCC相关性最密切的信号转导通路RAS-Raf-MEK-ERK信号通路。通过免疫蛋白印记实验验证,肝癌细胞瞬时转染细胞模型中,肝癌细胞在转染入HBx或CYP3A4质粒后,细胞中HBx或CYP3A4蛋白表达水平明显增高,表明重组质粒HBx和CYP3A4质粒瞬时转染细胞模型构建成功,能够在细胞中稳定表达成蛋白。同时对L02正常肝细胞系进行HBx浓度依赖型转染,并验证L02瞬时转染模型中HBx和CYP3A4的蛋白表达量。在转染重组质粒后,细胞中HBx或CYP3A4的蛋白表达量较转染空质粒的Mock-Mock组均显著提高,尤其在L02梯度转染模型中,随着HBx质量浓度的增加,细胞中HBx的蛋白表达水平也随之升高。同时,样品中CYP3A4的蛋白表达水平逐渐降低。因此细胞瞬时转染模型构建成功。在验证过的瞬时转染细胞模型中,针对RAS-Raf-MEK-ERK信号通路的考查结果表明,HBx能够有效激活RAS-Raf-MEK-ERK信号通路。HBx高表达的情况下,瞬时转染的肝癌细胞模型中RAS蛋白被激活,细胞中活化的RAS的表达量显著上升。同时RAS-Raf-MEK-ERK信号通路中主要作用元件Raf-1、phospho-Raf-1、MEK 1/2、ERK 1/2、PP2A和KSR等蛋白表达量也均有所升高。但随着CYP3A4的后续升高,细胞中活化的RAS蛋白及RAS-Raf-MEK-ERK信号通路中主要作用元件的蛋白表达水平较单独转染HBx组却显著下降。同样,在L02正常肝细胞的瞬时转染模型中,随着HBx蛋白表达的梯度升高,细胞中活化的 RAS 蛋白表达量,Raf-1、phospho-Raf-1、MEK 1/2、ERK 1/2、PP2A和KSR等蛋白的表达量亦随之升高,但在CYP3A4高表达后,能有有效抑制由HBx激活的RAS-Raf-MEK-ERK信号通路。RAS-Raf-MEK-ERK信号通路参与多种细胞的生理、生化功能,例如生长、增殖、分化、凋亡、迁移等。有文献报道,RAS蛋白是调节细胞生长、增殖、分化的重要信号元件,在肿瘤的发生发展过程中,RAS是肿瘤异常增殖及迁移能力增强的关键诱因。而作为其下游效应因子的细胞外信号调控激酶ERK(extraccllular signal-regulated kinase,ERK)在恶性肿瘤细胞中也有突出的生理贡献。上皮细胞-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT),是上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程,也是RAS-Raf-MEK-ERK信号通路激活的后续生物学反应。通过细胞划痕实验及Transwell实验考查HBx对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果显示HBx在转入肝癌细胞后,能够诱发肿瘤细胞的上皮间质转化。1型、2型、3型上皮间质转化标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail的蛋白表达水平均有所升高。而细胞划痕和迁移实验的结果则表明在HBx感染肿瘤细胞以后,使其获得了更强的迁移和侵袭能力。在HBx诱发肝癌细胞发生EMT的同时,转染HBx后再转染CYP3A4的HBx-CYP3A4组的实验结果则显示,HBx-CYP3A4组细胞中1型、2型、3型上皮间质转化标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail的蛋白表达水平较HBx-Mock组明显降低,肿瘤细胞的迁移和侵袭能也显著下降。即CYP3A4能有效逆转由HBx诱发的EMT过程。结论在由HBV诱发的HCC中,作为HBV病毒的功能蛋白,HBx能够有效地激活细胞中的 RAS 蛋白,使得 Raf-1、phospho-Raf-1、MEK 1/2、ERK 1/2、PP2A和KSR等蛋白表达量升高,从而激活完整的RAS-Raf-MEK-ERK信号通路。而RAS-Raf-MEK-ERK信号通路激活后,尤其引发的后续生理效应使得肿瘤细胞发生上皮间质转化,增加了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,提高了肿瘤细胞的恶性程度。但随着CYP3A4的转入,RAS蛋白的活化受到抑制,细胞中Raf-1、phospho-Raf-1、MEK 1/2、ERK 1/2、PP2A和KSR等的蛋白表达量也有所降低,肿瘤细胞的侵袭和迁移能力也有所下降。因此,作为肝脏中主要的药物代谢酶CYP3A4的高表达能够有效地逆转HBx对RAS-Raf-MEK-ERK信号通路的激活作用,同时降低HBx对肿瘤细胞迁移、侵袭能力的提升作用。由此提示我们,HBx作为HBV的主要功能蛋白,可以通过激活RAS-Raf-MEK-ERK信号通路有效诱发正常细胞向肿瘤细胞的转化,同时药物代谢酶CYP3A4也能够有效抑制由HBx诱发的HCC发生、发展的过程。为临床治疗HCC提供了新的靶位和思路。