【摘 要】
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目的:构建基于二代测序（Next generation sequencing,NGS）进行miniSTR分型的16-三体“NGS-miniSTR”复合检测体系,验证其作为16-三体检测分析方法的可行性,探讨其在染色体异常检测中的价值。以此探索研究为基础,以期为NGS-miniSTR三体检测新方法的建立和完善提供依据。方法:（1）收集日常检案中经CNV-seq诊断为正常核型及16-三体的自然流产组织
【基金项目】
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国家卫生计生委出生缺陷与生殖健康重点实验室开放课题（2020sys-kfkt-00051）；
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目的:构建基于二代测序（Next generation sequencing,NGS）进行miniSTR分型的16-三体“NGS-miniSTR”复合检测体系,验证其作为16-三体检测分析方法的可行性,探讨其在染色体异常检测中的价值。以此探索研究为基础,以期为NGS-miniSTR三体检测新方法的建立和完善提供依据。方法:（1）收集日常检案中经CNV-seq诊断为正常核型及16-三体的自然流产组织样本各70例,作为对照样本和病例样本;（2）筛选16号染色体上适合NGS的miniSTR位点,构建基于NGS平台的检测面板,对以上对照/病例样本进行测序分型,获得miniSTR分型数据;（3）根据样本/基因座覆盖深度（Depth of coverage,Doc）、等位基因读数占比（Allele read ratio,ARR）等参数对miniSTR分型数据进行质控分析;（4）通过直接计数法、曼-惠特尼U检验、k-means聚类分析、马氏距离（Mahalanobis Distance）等多种统计方法分析正常和16-三体的miniSTR分布差异,优化并构建检测体系,并根据Logistic回归、最大约登指数、ROC曲线及95%的参考范围等帮助建立基于NGS-miniSTR的16-三体判别分析方法;（5）以CNV-seq结果为参考标准,进行临床验证和评估,计算特异性、灵敏度,X~2检验分析其一致性,并根据相关公式对检测效能进行评估。结果:（1）筛选到11个满足NGS检测的miniSTR基因座建立初步的复合检测体系;（2）除了20个样本中D16S771外,所有的miniSTR均可成功分型。样本平均Do C为24869±9581（±S）,基因座平均Do C为2260±949（±S）,各基因座的等位基因覆盖度比均＞0.6;（3）直接计数法发现三等位基因模式具有特异性,其仅在16-三体中出现。经曼-惠特尼U检验发现单、双等位基因模式下ARR存在差异（p＜0.05）,而k-means聚类分析显示仅双等位基因模式下依赖ARR可将对照/病例样本正确区分为2类,而单等位基因模式下ARR无聚集中心。另外,k-means聚类分析和马氏距离方法均提示基因座D16S771偏离预期。借助Logistic回归、最大约登指数和ROC曲线确定了双等位基因模式ARR1:2具有较高的诊断价值,准确度、灵敏度、特异性分别为99.8%、98.6%、98.7%;（4）去除D16S771,优化检测面板,并依赖对照/病例样本中三等位基因模式和双等位模式ARR特征,结合最大约登指数对应的切断值及95%的参考范围建立了判别分析方法;（5）优化后的检测体系在28例临床样本中应用及验证,其灵敏度和特异性均为100%,与CNV-seq高度一致,且系统效能PII≈99.95%。结论:本课题成功构建了NGS-miniSTR 16-三体的实验检测体系及配套判别分析方法,揭示了三等位基因模式和ARR1:2是鉴定染色体数目的有效指标,验证了NGS-miniSTR作为16-三体的检测分析方法的可行性,为NGS-miniSTR技术作为三体检测的新方法提供了依据,有望替代常规STR方案在染色体异常检测中的应用。
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