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目的：1．原代脊髓神经元的分离、培养及鉴定；2．构建Ngb重组腺相关病毒（AAV-Ngb）并利用其转染大鼠脊髓神经元和脊髓组织细胞；3．研究AAV-Ngb对脊髓神经元氧化应激损伤的保护作用；4．研究AAV-Ngb对大鼠脊髓损伤的保护作用；5．探讨AAV-Ngb对大鼠脊髓损伤后JAK2/STAT3信号通路的影响。方法：1．采用Accutase酶消化联合机械法分离胚胎脊髓神经元，应用Nissl染色和免疫荧光染色法鉴定脊髓神经元；2．构建携带Ngb基因的重组腺相关病毒载体，Real-time PCR检测腺相关病毒滴度；以Ngb重组腺相关病毒感染原代脊髓神经元，通过荧光表达法判定感染复数（Multiplicities of infection, MOI）；以Ngb重组腺相关病毒注射局部脊髓组织，通过荧光显微镜观察EGFP荧光表达情况，应用Western blot检测转染后脊髓组织中Ngb的表达情况；3．采用H2O2建立原代培养脊髓神经元氧化应激损伤模型；按不同处理因素分为对照组、单纯损伤组、AAV-EGFP组和AAV-Ngb组；应用CCK-8试剂观察AAV-Ngb对神经元活性的影响；丙二醛(Malondialdehyde, MDA)和SOD试剂检测AAV-Ngb对神经元MDA、SOD的影响；超氧化物阴离子荧光探针（DHE）检测活性氧水平；Hoechst33342染色法和流式细胞术观察神经元凋亡水平；TMRM试剂检测线粒体膜电位；以及Western blot检测线粒体凋亡途径相关蛋白Bax、Bcl-2、cytochrome c和cleavedcaspase-3蛋白的表达水平。4．采用重物压迫建立大鼠脊髓损伤模型；通过BBB评分观察大鼠后肢运动功能；TUNEL荧光染色法检测脊髓组织细胞凋亡情况；neuN免疫荧光染色法检测脊髓组织中神经元存活情况；MDA及SOD试剂盒检测脊髓组织中MDA和SOD含量；Western Blot和免疫荧光染色法检测脊髓组织线粒体凋亡途径相关蛋白Bax、Bcl-2、cytochrome c和cleavedcaspase-3蛋白的表达情况；5．在大鼠SCI前、SCI后1h、3h、6h、12h、1d、3d、7d八个时间分别取材，通过Western blot检测SCI后JAK2/STAT3信号通路相关蛋白JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的表达水平；分别给予NS、AAV-EGFP、AAV-Ngb、AAV-Ngb+AG490预处理，取上述p-JAK2、p-STAT3表达峰值时间点作为观察时间点，Western blot法检测损伤脊髓组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的表达水平。结果：1．通过Accutase酶消化联合机械法获得的神经元产量高、细胞活性好；细胞尼氏染色可见大量的特异性尼氏体，并表达特异性蛋白βtubulin-Ⅲ，符合脊髓神经元的特征；2．成功构建Ngb重组腺相关病毒并测定其滴度；将AAV-Ngb成功转染至原代培养脊髓神经元中，确定了AAV-Ngb的最佳MOI值为105；将Ngb基因成功转染至大鼠脊髓组织细胞中，并证明转染AAV-Ngb的脊髓组织能持续高水平表达Ngb蛋白；3．成功建立原代培养脊髓神经元氧化应激损伤模型；与对照组相比，单纯损伤组、AAV-EGFP组和AAV-Ngb组神经元细胞活性、SOD含量、线粒体膜电位、Bcl-2和线粒体内cytocheome C显著下降，细胞MDA含量、细胞内活性氧水平、凋亡细胞、Bax、胞浆中cytochrome C和活化的caspase-3明显增加；与单纯损伤组相比，AAV-Ngb组神经元细胞活性、SOD含量、线粒体膜电位、Bcl-2和线粒体内cytochrome C明显提高，细胞MDA含量、细胞内活性氧水平、凋亡细胞、Bax、胞浆中cytochromeC和活化的caspase-3显著降低；4．成功建立大鼠重物压迫损伤模型；与对照组相比，单纯损伤组、AAV-EGFP组和AAV-Ngb组的运动功能以及脊髓组织SOD含量、Bcl-2和线粒体内cytochrome C显著下降，脊髓组织MDA含量、凋亡细胞、Bax、胞浆中cytochrome C和活化的caspase-3明显增加；与单纯损伤组相比，AAV-EGFP组的各个指标没有明显差异，AAV-Ngb组的运动功能以及脊髓组织SOD含量、Bcl-2和线粒体内cytochrome C明显增加，脊髓组织MDA含量、凋亡细胞、Bax、胞浆中cytochrome C和活化的caspase-3显著减少；5．p-JAK2和p-STAT3表达高峰时间点为SCI后12h；与对照组相比，单纯损伤组、AAV-EGFP组、AAV-Ngb组和AAV-Ngb+AG490组动物的p-JAK2和p-STAT3表达显著增加；与单纯损伤组相比，AAV-Ngb组和AAV-Ngb+AG490组动物的p-JAK2和p-STAT3表达明显增加；与AAV-Ngb组相比，AAV-Ngb+AG490组动物的p-JAK2和p-STAT3表达显著减少。结论：1．Accutase酶消化联合机械法分离的脊髓神经元产量高、细胞活性好和纯度较高；2．成功构建Ngb重组腺相关病毒，并将Ngb基因成功转染原代培养脊髓神经元或者脊髓组织中，实现Ngb的稳定高水平表达；3．过表达Ngb能改善原代脊髓神经元氧化应激损伤后神经元细胞活性，抑制氧化应激反应，减少细胞内活性氧，提高线粒体膜电位，抑制线粒体凋亡途径从而抑制细胞凋亡；4．过表达Ngb在体内能促进大鼠SCI后运动功能的恢复，抑制氧化应激反应，促进神经元的存活，抑制线粒体凋亡途径从而抑制细胞凋亡；5．过表达Ngb可能通过促进JAK2/STAT3通路的激活对SCI起保护作用。