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绿僵菌素A(destruxin A,DA)是由金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae产生的一种环缩羧肽类次生化合物,具有杀虫、抗病毒等生物活性,但是其作用机理尚不清楚。分离鉴定绿僵菌素A结合蛋白,明确其分子组成与结构及其与其他蛋白的相互作用关系,才能从根本上认识绿僵菌素A的分子作用机理。因此,本研究以家蚕Bombyx mori Bm12细胞为材料,利用酶解和电泳技术分离DA结合蛋白,应用质谱技术初步鉴定DA结合蛋白,通过同源建模和分子对接评估这些蛋白与DA结合作用;最后采用RNAi技术沉默相关转录因子,结合荧光定量PCR(q PCR)技术,明确DA处理或沉默TOLL和IMD信号通路相关转录因子后家蚕抗菌肽cecropin B和gloverin 4基因以及Bm Rel/Bm Relish基因表达的变化。主要研究结果如下:(1)绿僵菌素A结合蛋白的分离与鉴定用200μg/m L DA处理Bm12细胞6h后,提取总蛋白质,然后分别用链蛋白酶与蛋白酶K降解所提取的蛋白1、3、5 min,再进行电泳分离,结果发现,蛋白酶K降解后,DA处理的细胞与对照相比,增加三个电泳条带(A、B1、B2);而链蛋白酶降解的蛋白则没有发现差异条带。进而,将这些差异蛋白条带进行质谱鉴定,分析发现A、B1、B2三个条带中相同的蛋白质有112种,分子质量介于50~100 KDa之间。(2)绿僵菌素A结合蛋白的同源建模与分子对接从上述112种选取得分较高的26个蛋白,采用MOE 2014.09软件对其进行同源建模和分子对接分析。结果显示:26个蛋白与DA对接的自由能介于-9.93~-5.46kcal/mol之间,尤其是其中7种蛋白其对接自由能小于-8.00 kcal/mol,显示出与DA具有良好的结合效果。该26种蛋白功能涉及基因表达调控、分子伴侣、蛋白降解、蛋白合成和细胞结构蛋白等,其中基因表达调控蛋白6种,分子伴侣5种,蛋白降解酶4种,蛋白合成相关蛋白3种,细胞结构蛋白3种,能量代谢相关蛋白2种,免疫功能相关蛋白1种,跨膜运输相关蛋白1种,以及功能未知蛋白1种。(3)绿僵菌素A对家蚕抗菌肽cecropin B和gloverin 4基因表达的影响DA能引起抗菌肽cecropin B基因表达上调和gloverin 4基因表达下调。利用特异性si RNA分别沉默转录因子基因Bm Relish1、Bm Relish2、Bm Rel后,发现当单独沉默转录因子Bm Relish2基因时,cecropin B和gloverin 4基因表达下调,说明这两种抗菌肽的合成均通过IMD信号通路调控。当沉默Bm Relish1或Bm Rel基因及DA处理联合作用时,cecropin B基因显著下调,说明在抑制cecropin B的合成时,DA与转录因子Bm Relish1或者Bm Rel之间存在密切的协同效应;同样,在促进gloverin 4的合成时,DA与转录因子Bm Relish2之间也存在着协同效应。(4)绿僵菌素A影响转录因子Bm Rel/Bm Relish调控基因表达考察了DA对上述转录因子调控Bm045、Bm066和Bm133基因的影响,结果发现,Bm045和Bm066基因表现相似,当单独沉默Bm Relish1基因或者DA处理时,两个基因均下调表达,当沉默Bm Relish1基因和DA处理联合作用时,都上调表达;单独沉默Bm Relish2基因时,Bm045和Bm066基因表达上调,但是,沉默Bm Relish2基因和DA处理联合作用时,都下调表达;沉默Bm Rel基因和DA联合作用则不能引起这两个基因表达的变化。对于Bm133基因,发现单独沉默Bm Relish2基因或者DA处理时,其表达下调;沉默Bm Relish2基因和DA处理联合作用亦或分别沉默Bm Rel和Bm Relish1基因,其表达均上调。这些现象表明Bm045、Bm066和Bm133基因的表达和IMD信号通路有密切的关系,而且对于三个基因的表达,DA和转录因子Bm Relish1/2之间有协同作用。这些结果暗示DA可能促进转录因子Bm Relish的m RNA更多的剪切成Bm Relish2。