【摘 要】
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脊椎动物的免疫系统是一个高效、有序和体系,在维持机体的稳态过程中离不开免疫细胞。CD4+T辅助细胞（T help,Th）是特殊的免疫细胞群,在免疫系统中的起到桥梁作用,在其表面会表达CD4分子。在高等动物中,CD4受体是由一个拷贝基因编码的单链跨膜蛋白,其细胞外含有四个Ig样结构域;而在鱼类中,发现了两个拷贝的CD4基因,即CD4-1和CD4-2,其中胞外域表达的Ig样结构域为2-4个。在鱼类中,
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脊椎动物的免疫系统是一个高效、有序和体系,在维持机体的稳态过程中离不开免疫细胞。CD4+T辅助细胞（T help,Th）是特殊的免疫细胞群,在免疫系统中的起到桥梁作用,在其表面会表达CD4分子。在高等动物中,CD4受体是由一个拷贝基因编码的单链跨膜蛋白,其细胞外含有四个Ig样结构域;而在鱼类中,发现了两个拷贝的CD4基因,即CD4-1和CD4-2,其中胞外域表达的Ig样结构域为2-4个。在鱼类中,CD4-1和CD4-2基因在多种物种均有克隆和鉴定,对于其基因结构和遗传进化信息都有较多的研究,但是对于其抗体的制备和阳性细胞的分析研究确鲜有报道。草鱼（Ctenopharyngodon idella,Ci）,在2020年养殖产量达到了577.11万吨,是我国养殖数量和养殖面积较为巨大的品种。但是养殖密度的增加容易产生疾病和虫害问题,对草鱼免疫系统的研究,既可以加深对鱼类抗病作用机理的认识,也可以为开展人工免疫的药物进行早期实验室阶段的观察打下基础。在本研究中,根据NCBI上已有的草鱼CD4-1和CD4-2基因序列,我们将其抗原活性较强的胞外域进行重组表达质粒的构建,大量诱导大肠杆菌表达蛋白,使用AKTA蛋白纯化仪纯化成高纯度原核蛋白,并用于免疫小鼠,使其体内产生单克隆抗体。经过ELISA和蛋白质印迹初步筛选获得对原核重组蛋白特异性较强的抗体,再经CHO-S表达系统产生的真核蛋白以及共聚焦显微镜和流式细胞术的鉴定,表明所获取的Ci CD4-1和Ci CD4-2单克隆抗体与CHO-S细胞中表达的重组胞外域蛋白以及草鱼的天然CD4分子具有良好的特异性反应。其中,Ci CD4-1单克隆抗体不识别Ci CD4-2,反之亦然。此外,通过流式细胞术分析了健康鱼免疫组织中淋巴细胞的百分比,我们发现了草鱼CD4-1+和CD4-2+细胞的分布情况。总而言之,本研究所取得的成果如下:1.利用大肠杆菌表达系统,同时制备和纯化了草鱼CD4-1和CD4-2的原核蛋白,分子量大小分别为44 k Da和37 k Da。利用原核重组蛋白和草鱼的天然膜蛋白对小鼠进行免疫反应,成功纯化了CD4-1和CD4-2的单克隆抗体。2.使用CHO-S真核表达系统,制备CD4-1和CD4-2的真核蛋白,分别对单克隆抗体进行Western blotting分析,结果表明单克隆抗体具有良好的特异性,并且CD4-1和CD4-2抗体并不存在交叉反应现象。同时,CD4抗体能够识别草鱼原代头肾细胞的CD4分子,在共聚焦荧光显微镜下呈点状型分布于细胞膜上。3.采用单克隆抗体（GC7-CD4-1和GC7-CD4-2）进行流式细胞术,分析健康草鱼中各免疫组织中CD4-1+和CD4-2+细胞数量。分析显示此两种CD4+细胞占比存在明显差异,其中,CD4-1+细胞在头肾,脾脏和血液中分别为17.6±6.7%,13.1±5.4%和7.3±4.5%;而CD4-2+细胞占比为22.5±7.8%,18.6±9.9%,8.8±3.8%,两者在头肾中的占比最高,其次为脾脏,外周血中含量最少。
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