背景:睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4（Testis-specific serine/threonine-protein kinase 4,TSSK4）在雄性生殖细胞发育和精子成熟过程中发挥着重要作用。它可能参与 CRE/CREB 通路（cAMP-response element/cAMP-response element binding protein pathway）,通过在Ser-133上磷酸化CREB,刺激细胞中的CRE/CREB通路。TSSK4主要存在于精子,特别是精子的顶体和鞭毛中。近年来,有研究发现,TSSK4在睾丸中有高水平表达,在肺、肾脏、脾脏、脑和胸腺等器官中有较低表达。在真核细胞中,内质网对细胞中的脂质合成和蛋白质折叠、维持钙离子稳态具有重要的调节作用。当细胞受到外界刺激时,内质网摄取、释放Ca2+的动态平衡被打破,蛋白质的加工和运输过程受到阻碍,这些情况会引起内质网腔中错误折叠的蛋白和未折叠蛋白质增加并积累,从而导致内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）,随后导致未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）被激活。转录活化因子ATF6（activating transcription factor 6）是UPR中的主要信号传导分子,生理状态下,ATF6与GRP78/Bip蛋白结合,形成稳定的复合物;当内质网应激发生时,ATF6与GRP78/Bip蛋白分离,随后被高尔基体上的蛋白酶S1P和S2P水解成373个氨基酸的活化的ATF6（p50 ATF6）。p50 ATF6进入细胞核内,和启动子中的内质网应激反应元件（endoplasmic reticulum stress response element,ERSE）结合,促进含有ERSE的转录因子及UPR靶分子下游基因的转录,还可以协同促进IRE1（inositol-requiring protein 1α,肌醇依赖性激酶 1）诱导产生 XBP1（X-box binding protein 1,X-盒结合蛋白1）等蛋白,促进内质网对未折叠蛋白的正确折叠与转运,维持内质网稳态。如果ERS持续,UPR不能使内质网恢复稳态时,则会导致细胞凋亡。雄性生殖系统疾病的发生受到环境、遗传、生活习惯等多方面因素的综合影响,在临床上受到医务工作者和科研人员的高度重视。有研究结果表明,环境毒物引起的内质网应激会导致睾丸和附睾功能改变、生精细胞凋亡、精子数量和运动能力下降,从而导致雄性不育。ATF6作为内质网应激的感受器,可能与雄性生殖系统疾病密切相关。本研究进一步探索了 ATF6在雄性生殖过程中发挥的作用,为雄性生殖系统疾病的研究和治疗提供了新的思路。实验方法:通过收集临床正常人和不育患者的精液标本,对标本进行western blot实验,检测正常人和不育患者精液中精子p50ATF6的表达量;构建ATF6全身敲除小鼠动物模型,通过睾丸组织切片苏木精-伊红染色、小鼠精子计数和精子活力检测、测量小鼠生精小管面积、小鼠睾丸体重比、生育实验这六个表型实验探究ATF6的敲除对于雄性敲除鼠和雄性野生型小鼠精子发生的影响;利用转录物组测序信息筛选出ATF6下游基因TSSK4,并结合qPCR加以验证;通过启动子双荧光素酶报告基因实验、染色质免疫共沉淀实验确定p50 ATF6与下游基因TSSK4是否结合,以及可能的作用位点;通过western blot实验研究在293T细胞系中过表达p50ATF6对于下游基因TSSK4的影响;通过睾丸组织免疫组织化学染色检测TSSK4下游基因CREB以及phospho-CREB分别在雄性ATF6全身敲除小鼠和雄性野生型小鼠睾丸组织中的表达情况。研究结果:与正常对照组相比,部分临床不育患者精液中精子p50 ATF6的表达量明显降低甚至不表达。ATF6敲除鼠的繁殖周期与野生型小鼠相比明显延长,每胎只数减少,且雌鼠存在食仔现象。ATF6的敲除影响了雄性小鼠的精子发生过程,具体表现为与对照组野生型小鼠相比,ATF6敲除雄鼠睾丸发育延迟、精子计数和精子活力降低、生精小管面积和睾丸体重比均降低。通过转录物组测序筛选出ATF6的下游基因TSSK4,并在mRNA和蛋白水平上进行了验证。在293T细胞中探究p50 ATF6调控TSSK4的分子机制,通过双荧光素酶报告基因实验确定了 p50 ATF6能够促进TSSK4的启动子活性,且通过染色质免疫共沉淀实验验证了 p50 ATF6蛋白能与TSSK4的DNA序列相结合。同时,免疫组化结果表明ATF6敲除鼠睾丸中CREB表达量没有明显差异,但phospho-CREB表达量显著降低。结论:ATF6能通过对TSSK4的调控从而影响小鼠的生育能力。另一方面,ATF6能间接影响TSSK4下游基因的表达水平。