研究目的:通过课题组的前期实验结果和相关文献研究,我们发现抗焦虑作用是天然小分子酚(NSMPs)共有的一种生物活性且酚羟基是其必需基团。而酪氨酸及苯丙氨酸代谢通路中存在一类由神经递质DA及NE代谢产生的代谢产物—内源性小分子酚(ESMPs)。NSMPs与ESMPs在结构极为相似。我们提出假说:ESMPs与神经精神疾病之间存在密切关系,其特异性变化可以表征神经精神疾病;NSMPs通过调控ESMPs的代谢对神经精神疾病起到治疗作用。本研究首先建立靶向酚组学的分析方法,然后分别建立AD与焦虑症模型,考察ESMPs的特异性变化以及丁香酚与阿魏酸分别调控ESMPs发挥抗焦虑与治疗AD的作用机制。研究方法:1:基于UPLC-QqQ-MS/MS建立血浆ESMPs的定量分析方法。首先选择合适离子源与扫描方式,对离子通道、碰撞能量及锥孔电压等质谱参数进行优化;其次综合考察色谱条件,优化色谱柱、流动相种类、添加剂种类及体积分数、洗脱梯度、流速及柱温等色谱参数;最后进行标准曲线、定量限及检测限、精密度、稳定性及准确度等方法学考察,确定能够定量ESMPs的液质联用的分析方法;2:采用Morris水迷宫实验评价东莨菪碱诱导的阿尔茨海默症(AD)模型,然后基于靶向酚组学考察模型中ESMPs的特异性变化,筛选潜在的可以用来表征AD的ESMPs;同时考察阿魏酸治疗AD的作用以及通过调控ESMPs治疗AD的机制;3:采用高架十字迷宫实验建立焦虑样行为模型,然后基于靶向酚组学考察焦虑模型中ESMPs的特异性变化,筛选潜在的可以用来表征焦虑症的ESMPs;同时比较丁香酚抗焦虑的作用以及通过调控ESMPs抗焦虑的机制;4:利用RT-PCR及ELISA实验考察焦虑模型中ESMPs相关的代谢酶基因及蛋白表达以及丁香酚的调控基因与酶表达发挥抗焦虑作用的机制。研究结果:1:建立了靶向酚组学分析的UPLC-QqQ-MS/MS方法。其中28种ESMPs在既定线性范围内呈现良好的线性关系,R2>0.99,精密度低于20%,符合生物样本分析方法的要求,样本较为稳定,均未发生明显的降解、变质的情况,其中26种ESMPs的回收率高于70%,检测准确可靠。方法学结果符合《生物样品分析方法验证指导原则》和《中国药典》2015年版的相关要求。方法灵敏准确、稳定可靠,可用于血浆ESMPS谱的定量检测;2:东莨菪碱诱导的AD模型小鼠血浆中反式3-羟基肉桂酸(THCM)与4-羟基苯乙酸(HPAA)含量显著上调,3-(3-羟基苯基)丙酸(HPPT)、4-羟基苯甲酸(HBA)、3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸(PHCA)、水杨酸(SLA)与2,5-二羟基苯甲酸(DHBA)含量均显著下调。其中SLA与DHBA筛选为关键ESMPs,能够特异性表征AD的发病。阿魏酸能将其中代谢异常的6种ESMPs均回调至正常水平,表明从ESMPs的代谢层面,阿魏酸也具有较好的治疗AD的作用,且阿魏酸通过调控ESMPs的水平发挥抗AD疗效;3:焦虑大鼠血浆中3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸(PHCA)与3,4-二羟基扁桃醛(DOPEGAL)显著上调,4-羟基苯甲酸(HDPL)、2-羟基苯乙酸(HPAT)、4-羟基苯甲酸(HBA)、3,4-二羟基苯基丙酸(DHPP)、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(HMBH)、HVA与DHPG均显著下调。其中PHCA、DHPG及HVA筛选为关键ESMPs,能够特异性表征焦虑症的发病。丁香酚具有抗焦虑活性,且具有剂量依赖性。丁香酚能够将PHCA等6种ESMPs回调至正常水平,能够改善焦虑大鼠的ESMPs的代谢紊乱;4:焦虑模型组大鼠沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)、单胺氧化酶A(MAOA)及儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)的酶含量及基因表达明显上调,ALDH酶含量显著下降,基因表达显著上调,AR酶含量及基因表达显著下调;丁香酚能够有效抑制焦虑大鼠SIRT1、MAOA、COMT酶含量与基因表达的上调,回调乙醛脱氢酶(ALDH)的酶表达量与基因表达,上调醛糖还原酶(AR)的酶表达量。丁香酚通过调控SIRT1-MAOA信号通路,并且影响ESMPs相关代谢酶及基因表达发挥抗焦虑作用。研究结论:靶向酚组学的分析方法可同时检测26种ESMPs,方法灵敏准确、稳定可靠;AD及焦虑症中ESMPs的含量发生特异性变化;丁香酚与阿魏酸通过调控ESMPs分别发挥抗焦虑与治疗AD的作用。