机体抗氧化防御体系包括酶学和非酶学系统。酶学系统主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等。大量的证据表明GPx清除氢过氧化物的能力强于CAT。分子生物学和遗传学的证据都表明许多疾病的发生、发展都和活性氧(ROS)有关,如白内障、克山病、心脑血管疾病和衰老等,并且在发病过程中GPx的活力都不同程度的下降。因此GPx作为抗氧化药物前体有着广阔的应用前景。硒代半胱氨酸(Sec)是GPx催化必需基团,被认为是第二十一种氨基酸,它以UGA为对应密码子。Sec掺入蛋白质的机制目前还不十分清楚。实现生物硒蛋白的原核表达尚有困难,这限制了GPx的生物医学应用。因此本论文试图应用化学和生物学技术模拟硒酶GPx的酶学行为。模拟GPx不仅能阐明酶的机理,而且具有实际应用价值。如何产生高催化效率的GPx人工酶,对化学家和生物学家是一个长期的目标。我们从GPx的本质出发,利用化学和生物学的方法和原理,设计并制备出新颖的高活力的GPx人工酶。主要内容包括:1.硒代枯草杆菌蛋白酶模拟GPx我们利用定点突变和硒蛋白的缺陷型原核表达系统成功地将枯草杆菌蛋白酶(subtilisin E)活性部位221位的Ser转变为GPx催化基团Sec,获得了具有高GPx活力的含硒酶(seleno- subtilisin E)。研究表明此种方法适用于在蛋白质主链任何位置引入催化基团Sec,克服了化学突变引入硒的缺陷。由于目的蛋白seleno-subtilisin E在细胞中大量表达,主要以包涵体的形式存在,我们从包涵体中提取该蛋白,得到了高活性、高产量的硒代枯草杆菌蛋白酶。实验证明,目的蛋白的硒原子在变性和复性过程中并没有脱落,该实验的成功提供了一种获得高活性、高产量含硒酶的好方法。而且,本实验的成功为我们对该酶进行结构和功能的进一步研究打下了坚实的基础。2.设计硒代枯草杆菌蛋白酶活性中心依据酶学原理,我们提出“底物识别与合理配置催化基团协同仿酶”的研究新思路,设计并改造了枯草杆菌蛋白酶活性中心,制备出具有高催化活性的人工硒酶—枯草杆菌蛋白酶。为了提高酶的硒酶催化活力,我们结合计算机分子模拟,在该酶的底物结合口袋边缘找到了与底物结合好,并且催化位点硒与底物反应性巯基在空间匹配的最佳位点(Ser63)。我们利用硒蛋白的缺陷型表达方法将枯草杆菌蛋白酶63位的丝氨酸(Ser63)突变成硒代半胱氨酸(Sec63),获得了新的硒代枯草杆菌蛋白酶seleno63-subtilisin E.3.硒代枯草杆菌蛋白酶催化动力学研究新的硒代枯草杆菌蛋白酶对芳香巯基底物ArSH表现出相当高的清除各类氢过氧化物的能力。对疏水的氢过氧化物选择性最好,其催化还原枯稀过氧化氢的活力达2570μmol·min-1·μmol-1,达到天然GPx的活力水平(如兔肝GPx为5780μmol·min-1·μmol-1)。其催化能力大大由于小分子GPx模拟物二苯二硒,是其催化能力的3700,000倍。对该酶的详细的催化动力学研究表明,seleno63-subtilisin E的GPx活力比原来的seleno221-subtilisin E提高了两个数量级,二级速率常数kmax/KArSH和kmax/Kt-BuOOH分别提高了2倍和96倍。这种新的设计不仅大大提高了该酶以ArSH为底物的GPx活力,而且扩展了巯基底物特异性识别范围,产生了以天然GPx底物GSH为还原剂的GPx活力;更值得注意的是该酶不但具有优良的GPx活性,还保留了天然枯草杆菌蛋白酶的水解酶的活性。