【摘 要】
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研究目的:活血地龟汤（HXDGT）是临床治疗糖尿病肾脏病（DKD）的有效方药,前期研究发现本方有改善DKD患者肾损伤的作用,但其具体作用机制仍不明确。本研究拟通过复制DKD小鼠模型及干预足细胞（MPC5）模型,观察HXDGT对花生四烯酸（AA）代谢途径以及足细胞铁死亡的影响,探索HXDGT干预DKD的潜在作用机制。研究方法:1、依据前期对本病的研究方法及参照文献,对C57BL/6J小鼠进行腹腔注射
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研究目的:活血地龟汤（HXDGT）是临床治疗糖尿病肾脏病（DKD）的有效方药,前期研究发现本方有改善DKD患者肾损伤的作用,但其具体作用机制仍不明确。本研究拟通过复制DKD小鼠模型及干预足细胞（MPC5）模型,观察HXDGT对花生四烯酸（AA）代谢途径以及足细胞铁死亡的影响,探索HXDGT干预DKD的潜在作用机制。研究方法:1、依据前期对本病的研究方法及参照文献,对C57BL/6J小鼠进行腹腔注射链脲佐菌素（STZ）制备动物模型,第12周根据尿蛋白定量结果,对模型成功的小鼠随机分为模型组（DKD）,以及HXDGT高、中、低剂量用药组,和ACSL4抑制剂罗格列酮（RSG）组,分别为DKD+HXDGT（H）、DKD+HXDGT（M）、DKD+HXDGT（L）和DKD+RSG,另设正常对照组（Control）,连续灌胃12周后检测相关指标。2、灌胃结束后,收集小鼠血、尿标本,进行生化指标检测。3、HE染色检测小鼠肾脏组织病理改变,Masson染色检测肾脏组织中胶原蛋白沉积水平,PAS染色检测小鼠肾脏组织中糖原沉积水平,普鲁士蓝染色检测肾脏铁沉积水平,电镜观察小鼠肾小球和线粒体的改变。4、免疫组化、蛋白免疫印迹法（WB）和Real-time PCR（q PCR）检测肾脏组织中足细胞指标Nephrin、Podocin的表达水平,花生四烯酸代谢蛋白以及铁死亡蛋白ACSL4、12-LOX和GPX4的表达。5、对既往购买的小鼠永生足细胞细胞系（MPC5）,进行复苏传代培养。采用高糖（HG）刺激MPC5造模,分为PBS组、HG组、HG+HXDGT组、HG+RSG组和HG+ML355组。另用花生四烯酸（AA）诱导MPC5,分为PBS组、AA组、AA+HXDGT组、AA+RSG组和AA+ML355组,其中RSG为ACSL4抑制剂,ML355为12-LOX的抑制剂。6、通过免疫荧光、WB和q PCR检测MPC5中足细胞指标Nephrin、Podocin的表达水平,花生四烯酸代谢蛋白以及铁死亡蛋白ACSL4、12-LOX和GPX4的表达。结果:1、药物干预12周后,进行肾功能相关指标检测,与Control组小鼠相比,DKD组小鼠血糖、24h尿蛋白、肌酐、尿素氮大幅上升（P＜0.01）,C肽和胰岛素下降明显（P＜0.01）;与DKD组相比,HXDGT不同剂量治疗和RSG治疗后,小鼠血糖、24h尿蛋白、肌酐、尿素氮指标明显下降（P＜0.01,P＜0.05）,C肽和胰岛素增加（P＜0.01,P＜0.05）,其中DKD+HXDGT（M）组治疗效果最为明显（P＜0.01）。2、肾组织特殊病理染色结果显示,与Control组小鼠相比,DKD组小鼠肾组织系膜增生增宽,肾小管上皮细胞发生空泡变性,肾脏充斥糖原阳性物质,且胶原沉积明显,给予HXDGT和RSG干预后,小鼠的肾脏组织病理损伤得到不同程度改善,中剂量改善最为明显。电镜观察发现HXDGT和RSG干预后,小鼠肾小球足突改善明显,线粒体损伤修复,线粒体脊断裂减少,炎性物质减少,以HXDGT中剂量组疗效显著。3、通过检测肾组织中AA代谢指标和铁死亡相关指标,发现与Control组小鼠相比,DKD组小鼠肾组织中足细胞相关蛋白Nephirn、Podocin和铁死亡关键蛋白GPX4的蛋白表达和m RNA表达明显降低（P＜0.01,P＜0.05）,AA代谢和铁死亡关键蛋白ACSL4、12-LOX的蛋白表达和m RNA表达显著上升（P＜0.01）;与DKD组相比,HXDGT不同剂量和RSG干预后,Nephirn、Podocin和GPX4指标升高（P＜0.01,P＜0.05）,ACSL4、12-LOX表达降低（P＜0.01）,且HXDGT中剂量组为最佳干预组。4、在HG和AA刺激导致MPC5细胞损伤的模型中,HXDGT同样能够分别增加Nephirn、Podocin和GPX4蛋白及m RNA的表达（P＜0.01,P＜0.05）,降低ACSL4、12-LOX蛋白及m RNA的表达（P＜0.01,P＜0.05）,且与ACSL4和12-LOX的抑制剂RSG、ML355干预后的表达一致,HXDGT组为最佳干预组。结论:1、HXDGT能够通过改善DKD小鼠肾功能,缓解肾损伤,延缓DKD进展。2、HXDGT可能通过抑制AA代谢和铁死亡,抑制ACSL4、12-LOX表达,增强GPX4表达水平,改善足细胞损伤,从而发挥治疗DKD作用。
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