论文部分内容阅读
硒（Se）是人和动物-维持机体正常生命活动的一种必需微量元素。缺硒可引发多种器官组织损伤并导致多种营养代谢性疾病,如渗出性素质。骨骼肌是硒缺乏主要的靶组织之一。在机体内硒的生物学功能是通过硒蛋白来实现的。硒蛋白T（Selenoprotein T,SelT）是硒蛋白家族的重要一员,在多个组织中丰富表达且对抗氧化、钙稳态、神经及内分泌系统有重要调节作用。目前,对SelT的研究大多集中于哺乳动物,禽类SelT的研究甚少,并且关于SelT对骨骼肌发育影响的研究仍是空白。MicroRNA（miRNA）是一类保守的非编码小分子RNA,它能够特异性的与靶基因结合并降解mRNA或抑制其蛋白翻译,最终来调控靶基因转录后表达。MicroRNA涉及许多生物学过程,并在细胞增殖、分化、发育、凋亡过程中扮演着重要的角色。miR-365-3p作用广泛,参与很多病理过程,但是在骨骼肌发育方面未见报道。本研究通过复制缺硒鸡模型,观察骨骼肌显微结构,检测肌肉发育相关因子、线粒体生物合成相关因子以及与肌肉发育相关钙通道基因的表达情况;通过生物信息学预测方法靶向SelT microRNA（miRNA）,建立敲低和过表达miR-365-3p的鸡胚成肌细胞模型,建立SelT敲低鸡胚成肌细胞模型,检测肌肉发育相关因子、线粒体生物合成指标、Ca2+水平和与肌肉发育相关钙通道基因;同时,建立miR-365-3p敲低、过表达的鸡胚模型和SelT敲低鸡胚模型,观察鸡胚骨骼肌显微结构,检测肌肉发育相关因子、线粒体生物合成有关因子以及与肌肉发育相关钙通道基因,以期揭示SelT在鸡胚骨骼肌发育中的生物学功能。试验结果如下:（1）硒缺乏可导致骨骼肌纤维横截面积减小,肌纤维空隙变大、排列不紧密,显著下调了骨骼肌中SelT的表达。MYF-5、MyoD、myogenin、MRF4和MHC的表达量显著降低,MSTN和p21的表达量显著上升。PGC-1α、NRF1和TFAM表达降低,STIM1和TRPC1表达减少。结果表明,缺硒从肌肉发育相关因子、线粒体生物合成、与肌肉发育相关钙通道基因三方面影响了骨骼肌的发育。（2）生物信息学预测结果显示SelT为miR-365-3p的靶基因,利用荧光素酶检测和Western blot方法对靶基因进行验证,确认SelT为miR-365-3p的靶基因。（3）利用细胞转染技术构建鸡胚成肌细胞miR-365-3p过表达和敲低模型及SelT敲低模型;利用胚下腔注射途径建立miR-365-3p过表达和敲低鸡胚模型以及SelT敲低鸡胚模型。形态学观察发现,miR-365-3p过表达组和SelT敲低组的成肌细胞细胞体部分减少,细胞间隙变大,细胞间连接减少,甚至一些细胞出现死亡;miR-365-3p敲低组的成肌细胞的不佳状态可得到缓解。在鸡胚模型中,miR-365-3p过表达时,鸡胚骨骼肌纤维横截面积减小,肌纤维间隙增大、排列疏松和分布不均;SelT敲低时鸡胚骨骼肌肌纤维情况与miR-365-3p过表达组类似。（4）在鸡胚成肌细胞与鸡胚模型当中,过表达miR-365-3p和SelT敲低时利于骨骼肌发育的MYF-5、MyoD、myogenin、MRF4、MHC受到下调,阻碍骨骼肌发育的MSTN、p21表达增加;敲低miR-365-3p后则出现相反趋势。结果表明,miR-365-3p可调控SelT通过肌肉发育相关因子影响骨骼肌发育。（5）在鸡胚成肌细胞与鸡胚模型中,过表达miR-365-3p、SelT敲低时PGC-1α、NRF1、TFAM、表达下降,细胞内的线粒体数目和ATP含量减少;但是敲低miR-365-3p上述指标表达增加。结果表明,miR-365-3p可调控SelT通过线粒体生物合成途径影响骨骼肌发育。（6）在鸡胚成肌细胞与鸡胚模型中,过表达miR-365-3p和SelT敲低试验组STIM1、TRPC1表达减少;成肌细胞的细胞质、线粒体、内质网钙离子水平降低;敲低miR-365-3p以后得到相反的试验结果。因此结果表明,miR-365-3p可调控SelT通过Ca2+途径影响骨骼肌发育。