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Ahp为幽门螺杆菌烷基过氧化氢还原酶,属于过氧化物酶家族,编码的蛋白质分子量为23kD。由于在分解过氧化氢和相关的过氧化氢衍生物过程中起到非常关键的作用,ahpC基因主要催化生物体内有机过氧化氢物分解成乙醇,因此受到极大关注。AhpC是双组分系统,由蛋白AhpF和AhpC组成。Wang等发现缺失ahpC基因的幽门螺杆菌突变株对氧化应激更加敏感,而抗氧化应激能力直接影响幽门螺杆菌在小鼠胃内定值。本研究采用PCR方法获得ahpC基因全序列,并通过设计合适的酶切位点,构建原核表达载体。对筛选鉴定的阳性克隆进行诱导条件的优化,使之高效表达融合蛋白,用Ni2+离子亲和层析法纯化融合蛋白,通过免疫日本大耳白兔制备抗融合蛋白的多克隆抗体。ELISA方法验证多克隆抗体的效价。为下一步实验验证cagA基因对ahpC的作用奠定基础。方法1.本研究结合pET-30a质粒载体特点,使用primer 5.0引物设计软件设计ahpC基因PCR引物,使上游引物带NdeⅠ酶切位点,下游引物带XhoⅠ酶切位点。2.运用PCR技术从Hp27DNA中扩增ahpC基因,试剂盒回收ahpC DNA后,连接转化入克隆载体pMD18-T中,验证转化效果。3.双酶切重组克隆质粒pMD18-T-ahpC和原核表达载体pET-30a,酶切产物回收后,构建重组原核表达载体pET30a-ahpC,转化入大肠杆菌BL21中进行阳性克隆筛选鉴定。4.本研究设立不同诱导条件,条件分别为不同的诱导时间和不同的IPTG浓度,对筛选出的阳性克隆的诱导表达条件进行优化。5.本实验融合蛋白带有6个His标签的特性,使用Ni-NTA柱纯化目的蛋白。6.纯化后融合蛋白与弗氏佐剂超声乳化混合,免疫日本大耳白兔,免疫4次,每次间隔7天。7.本研究采用心脏取血的方法,获得日本大耳白兔的血清,运用ELISA方法检测多克隆抗体的抗体效价。结果1.本实验运用PCR方法扩增出ahpC基因,基因长度为594bp,将基因转入克隆载体pMD—18T中,并转入大肠杆菌DH5α中。2.本实验成功构建了ahpC原核表达载体pET30a-ahpC,并将其转入大肠杆菌BL21中。3.对原核表达载体pET30a-ahpC的表达条件进行优化,实验发现原核表达载体在0.3mmol/l IPTG诱导5h时,蛋白表达量最高。4.本实验通过离子亲和层析柱纯化融合蛋白,获得了高纯度的融合蛋白,蛋白质分子量为23000。5.本实验使用融合蛋白免疫日本大耳白兔后,产生的多克隆抗体稀释6400倍后,效价仍然达到17.33。结论1.本实验成功构建了ahpC基因的原核表达载体,并对其诱导表达条件进行了优化。2.纯化的融合蛋白rahpC免疫日本大耳白兔后,可以产生抗融合蛋白的多克隆抗体,为下一步实验奠定基础。