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目的:探究新型小分子酪氨酸激酶抑制剂DCC-2036对三阴性乳腺癌干细胞的影响及相关机制,为难治性TNBC的治疗提供潜在的候选药物。方法:1.培养MDA-MD-231、HS-578T细胞系并使其稳定传代;通过流式细胞术检测醛脱氢酶ALDH+干/祖细胞群、微球体培养实验、Western Blot检测干细胞标志物的表达,观察DCC-2036对TNBC细胞系MDA-MB-231、HS-578T的CSCs的抑制作用。2.通过Western Blot观察DCC-2036对TNBC细胞中KLF5及其下游靶基因的抑制作用,并通过转染KLF5质粒探讨KLF5高表达对DCC-2036抑制TNBC干细胞效果的影响,以明确KLF5是否介导DCC-2036对TNBC干细胞的抑制作用。通过q RT-PCR、放线菌酮(CHX)示踪实验、蛋白酶体抑制剂MG132阻断实验等探讨DCC-2036是否通过降低KLF5的蛋白稳定性降低KLF5的表达。通过Western Blot、q RT-PCR等实验观察DCC-2036处理后AXL活性和表达及KLF5的改变,敲低/激活AXL后KLF5及其下游的表达变化,以研究DCC-2036是否通过抑制AXL降低KLF5的蛋白稳定性。通过Western Blot实验观察DCC-2036和AXL激活因素处理后Akt/GSK3β信号通路关键蛋白的变化。结果:1.体外细胞学实验证明DCC-2036对TNBC干细胞具有抑制作用。流式细胞术结果显示:与对照组相比,DCC-2036明显降低了TNBC细胞MDA-MB-231和HS-578T中ALDH+细胞群的比例。微球体形成实验显示:与对照组相比,DCC-2036也显著减少了由两种细胞系形成的微球体的数量和体积。Western Blot结果显示:DCC-2036下调了MDA-MB-231中干细胞相关标志物的蛋白表达。2.机制上,DCC-2036可能通过AXL/Akt/GSK-3β/KLF5轴从而抑制TNBC CSCs。(1)Western Blot结果显示:DCC-2036明显抑制了TNBC细胞中KLF5及其下游靶基因Nanog和FGF-BP1的蛋白水平的表达。转染KLF5质粒通过Western Blot和微球体培养结果显示:过表达KLF5部分逆转了DCC-2036对TNBC干细胞的抑制作用。(2)通过q RT-PCR技术我们发现在MDA-MB-231细胞中,DCC-2036显著降低KLF5靶基因Nanog的m RNA水平,但DCC-2036并不降低KLF5 m RNA水平。通过放线菌酮示踪实验发现,与阴性对照组相比,DCC-2036显著加速了MDA-MB-231和HS-578T细胞中KLF5的降解。而蛋白酶体抑制剂MG132可以挽救DCC-2036诱导的KLF5在两种细胞系中的下降。(3)敲低AXL降低了KLF5及其下游靶基因Nanog的蛋白水平,MG132也阻断AXL敲低诱导的KLF5下调。但是q RT-PCR技术结果显示:敲低AXL显著降低Nanog的m RNA水平却不降低KLF5的m RNA水平。而在MDA-MB-231细胞中用小干扰RNA(si RNA)敲低MET或P65检测KLF5的变化,结果发现KLF5蛋白表达水平未发生明显变化。(4)通过Western Blot实验结果显示:在MDA-MB-231和HS-578T细胞中,DCC-2036处理后AXL/Akt/GSK-3β/KLF5信号通路的关键蛋白水平发生下降,而AXL激动剂Gas6处理后AXL/Akt/GSK-3β/KLF5信号通路后蛋白水平的表达增加。结论:DCC-2036通过靶向AXL抑制Akt/GSK3β信号通路调控KLF5的蛋白稳定性抑制TNBC CSCs。