脂肪组织是非常重要的脂质储存和内分泌器官,可以调节全身代谢稳态,并与动脉粥样硬化性心血管系统疾病密切相关。脂肪营养不良是罕见的异质性疾病,分为遗传性和后天获得性,以不同程度的身体脂肪减少和相关的代谢并发症为特征的疾病,包括胰岛素抵抗、血脂异常、肝脂肪变性和动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）的易感性增加等。Seipin是二型先天性全身脂肪营养不良（CGL2）的致病基因,可以调节脂滴扩张并影响脂肪新生。Seipin缺陷导致全身脂肪缺失、脂肪肝及胰岛素抵抗等代谢异常表型。我们前期的研究发现,Seipin与3-磷酸甘油酰基转移酶（GPAT）存在相互作用,能够影响GPAT活性。敲低GPAT3能够改善Seipin缺陷的细胞脂滴形态异常和脂肪新生障碍。提示Seipin缺陷导致的异常表型可能是通过GPAT3引发的,但是尚缺乏哺乳动物实验证据。本研究第一部分利用基因工程小鼠模型,在整体动物水平探讨GPAT3敲除对Seipin缺陷小鼠的代谢异常表型的改善作用,阐明GPAT在Seipin缺陷引发脂肪营养不良中的作用。以往大量的实验证实肥胖能够加重动脉粥样硬化（As）进展,而脂肪组织减少与As的报道并不多见。我们前期的研究发现,Seipin缺陷能够加重LDLR敲除（LDLR-KO）小鼠的动脉粥样硬化（As）;Seipin-/-LDLR-/-小鼠还表现出极度高甘油三酯血症、高胆固醇血症。Seipin缺陷加重As是由于脂肪组织的缺失,还是基因缺陷本身引起,尚无定论。本研究第二部分利用手术去除LDLR-KO小鼠脂肪组织,观察脂肪组织部分缺失的LDLR-KO小鼠全身血脂稳态、脂肪肝及胰岛素敏感性,以及As的病变情况,以期证明全身脂肪组织的维持对代谢稳态及As的作用。第一部分GPAT3敲除改善Seipin缺陷的异常代谢表型目的:利用基因工程小鼠模型,在整体动物水平探讨GPAT3敲除对Seipin缺陷小鼠的高甘油三酯血症、胰岛素抵抗、脂肪肝、脂肪组织萎缩等异常表型的改善作用,阐明GPAT在Seipin缺陷引发脂肪营养不良中的作用。方法:应用CRISPR/Cas9系统,在小鼠上同时敲除Seipin和GPAT3（DKO）,与Seipin单基因敲除（SKO）小鼠比较,并以野生型（WT）和GPAT3单基因敲除（G3-KO）小鼠为参照。基因组DNA PCR后电泳及测序鉴定小鼠基因型;采用酶反应比色法测定血糖、血脂水平;免疫组化及H&E染色确定脂肪组织表型变化;MEF细胞油酸孵育及诱导分化确定脂滴形态及脂肪细胞分化能力;罗格列酮喂饲确定Pparg激动剂对脂肪新生及小鼠代谢表型的影响。结果:1.成功构建Seipin-GPAT3双敲小鼠基因组DNA PCR后电泳及测序鉴定小鼠基因型以及Western Blot在m RNA和蛋白水平明确了敲除小鼠无Seipin和/或GPAT3的表达。2.GPAT3敲除能够改善SKO小鼠高脂血症对血浆总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）以及非酯化脂肪酸（NEFA）检测,显示GPAT3敲除能够改善SKO小鼠轻度的高胆固醇血症,但不能纠正SKO小鼠长时间禁食后血浆的低TG和低NEFA水平。3.GPAT3敲除能够部分纠正SKO小鼠脂肪缺失我们对四组小鼠的皮下脂肪、附睾脂肪以及棕色脂肪进行分析,评价GPAT3敲除对SKO小鼠脂肪萎缩表型的改善作用。发现与SKO小鼠相比,DKO小鼠的皮下脂肪和附睾脂肪重量均升高两倍左右,脂肪组织H&E染色显示DKO小鼠脂肪细胞数目增多,脂滴大小更为均一。棕色脂肪组织的重量恢复更为显著。与SKO小鼠相比,DKO小鼠的皮下脂肪中的脂肪分化、脂质合成等基因表达有所增加。利用ELISA对四组小鼠血浆脂肪因子Leptin进行检测,发现DKO组较SKO组升高2倍左右,提示DKO小鼠脂肪组织的分泌功能明显增强。F4/80免疫组化以及Masson染色显示,DKO小鼠脂肪组织的巨噬细胞浸润和纤维化水平明显减少。可见GPAT3敲除可以部分改善SKO小鼠的脂肪萎缩表型。4.Seipin-GPAT3敲除小鼠出现白脂棕脂化表型我们还发现DKO组皮下脂肪和附睾脂肪中棕脂标志基因Ucp1、Cidea、Elovl3以及Cox8b的m RNA水平显著上调,提示白脂棕脂化。Ucp1的Western Blot及免疫组化进一步证实DKO小鼠的白色脂肪出现了棕脂样的改变,有利于改善全身代谢异常表型。5.GPAT3敲除能够改善SKO小鼠胰岛素抵抗和脂肪肝Seipin缺陷小鼠会发生严重的脂肪肝和全身胰岛素抵抗。肝脏H&E及油红O染色显示,DKO小鼠肝脏脂质沉积明显减少;肝脏脂质抽提TG含量测定,显示DKO小鼠肝脏的TG含量显著降低,说明GPAT3敲除能够明显减轻SKO小鼠的脂肪肝。血浆胰岛素水平测定、葡萄糖耐量及胰岛素耐量结果显示,DKO小鼠血浆胰岛素水平明显下调,葡萄糖耐量改善,胰岛素敏感性增加,提示GPAT3敲除明显减轻SKO小鼠的胰岛素抵抗。6.GPAT3敲除能够部分纠正Seipin缺陷引发的脂滴形态异常及脂肪新生障碍为了确定GPAT3敲除对Seipin缺陷引发的脂滴形态异常及脂肪新生障碍的影响,我们提取了四组小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）。油酸孵育后观察脂滴的表型,发现与细胞系实验一致,SKO小鼠出现了脂滴形态的异质性,既众多小脂滴并分散着超大脂滴,而DKO小鼠脂滴直径呈现良好的均匀性,明显改善脂滴的形态异常。对MEF进行成脂肪细胞诱导分化,之后油红O染色,结果显示SKO小鼠脂肪新生障碍,观察不到成熟脂肪细胞,而DKO组可见少量成熟脂肪细胞。可见GPAT3敲除可以部分纠正SKO小鼠的脂肪新生障碍。7.罗格列酮喂饲增强四组小鼠的胰岛素敏感性我们还对四组小鼠进行了脂肪分化关键核受体过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Pparg）的激动剂罗格列酮（Rosi）喂饲。发现Rosi喂饲后能够增加四组小鼠皮下脂肪的重量,增强胰岛素敏感性。小结:我们的研究显示,GPAT3敲除可以增加SKO小鼠脂肪组织的重量,部分改善脂肪组织形态异常及分泌功能障碍,并出现了白脂棕脂样的改变。GPAT3敲除能够明显减轻SKO小鼠的脂肪肝及胰岛素抵抗等全身代谢紊乱。GPAT3敲除还能够纠正SKO小鼠的MEF细胞脂滴形态异常及分化障碍。可见,在整体动物水平上,GPAT3敲除可以部分改善Seipin缺陷引发的脂肪萎缩及代谢异常表型。第二部分脂肪缺失对LDLR-/-小鼠代谢表型及动脉粥样硬化的影响目的:利用手术去除LDLR敲除（LDLR-KO）小鼠白色脂肪组织（WAT）和/或棕色脂肪组织（BAT）,观察脂肪部分缺失的LDLR-KO小鼠全身血脂稳态、脂肪肝及胰岛素敏感性,以及As的病变情况。以期证明全身脂肪组织的维持对代谢稳态及As的作用。方法:利用手术去除LDLR-KO小鼠腹股沟处皮下脂肪、附睾脂肪或肩胛骨处棕色脂肪,模拟全身性脂肪营养不良。采用酶反应比色法测定血糖、血脂水平;免疫组化及H&E染色确定脂肪组织表型变化;免疫组化及油红O染色确定脂肪缺失对As的影响。结果:1去除腹股沟处皮下脂肪、附睾脂肪和肩胛骨处棕色脂肪3部位实验结果1.1 3部位脂肪去除小鼠显示轻度的高胆固醇血症对血浆总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）以及非酯化脂肪酸（NEFA）检测,3部位脂肪去除小鼠显示轻度的高胆固醇血症。1.2 3部位脂肪去除小鼠显示加重的胰岛素抵抗全身性脂肪营养不良小鼠会发生严重的脂肪肝和全身胰岛素抵抗。肝脏H&E及油红O染色显示,3部位脂肪去除小鼠肝脏脂质沉积明显加重;肝脏脂质抽提TG、TC含量测定,显示3部位脂肪去除小鼠肝脏的TG、TC含量显著升高,说明3部位脂肪去除能够明显加重LDLR-KO小鼠的脂肪肝。我们还发现3部位脂肪去除组肝脏CHOP蛋白的表达水平明显上调,提示可能出现内质网应激。血浆胰岛素水平测定、葡萄糖耐量及胰岛素耐量结果显示,3部位脂肪去除小鼠血浆胰岛素水平明显升高,葡萄糖耐量受损,胰岛素敏感性降低,提示3部位脂肪去除明显加重LDLR-KO小鼠的胰岛素抵抗。1.3 3部位脂肪去除小鼠残存脂肪代偿性增大我们对3部位脂肪去除组小鼠的肾周脂肪、肠系膜脂肪进行分析,评价脂肪去除对残存脂肪的作用。发现与假手术小鼠相比,3部位脂肪去除小鼠的肾周脂肪和肠系膜脂肪重量均明显升高,脂肪组织H&E染色显示3部位脂肪去除小鼠脂肪细胞有所增大。我们还发现3部位脂肪去除组肾周脂肪、肠系膜脂肪中与脂肪合成相关基因表达上调,与脂肪水解相关基因HSL和ATGL的表达有所下调,脂肪组织p-AKT的表达也明显上调。可见3部位脂肪去除小鼠残存的脂肪出现代偿性增大,脂肪组织胰岛素敏感性增强。1.4 3部位脂肪去除小鼠的As并未加重为了确定3部位脂肪去除对As的影响,我们对主动脉全长及主动脉根部进行油红O染色,并对主动脉根部进行天狼星红、H&E、CD68、SM22α染色。与照组相比,3部位脂肪去除后As病变面积没有改变、As病变部位的CD68蛋白的表达、血管平滑肌细胞SM22α蛋白的表达、血管胶原含量均没有改变,但血管面积及官腔面积均较对照组减小,提示出现了异常的血管重构。2去除LDLR-KO小鼠腹股沟处的皮下脂肪、和/或附睾脂肪实验结果高脂喂饲之后,脂肪去除组小鼠与对照组相比血浆胆固醇水平、肝脏脂质沉积、肝脏内甘油三酯和胆固醇含量及As病变面积均没有改变。与对照组相比,附睾脂肪去除组的皮下脂肪重量明显增加,可能与甘油三酯的合成增加有关。小结:3部位脂肪去除组小鼠出现高胆固醇血症、加重脂肪肝及胰岛素抵抗,As病变面积没有影响。皮下和/或附睾脂肪去除组小鼠没有出现明显的代谢异常及As病变面积改变。可见,去除部分脂肪组织,并未加重LDLR-KO小鼠的As。结论:GPAT3敲除能够部分纠正Seipin缺陷引起的脂肪缺失、脂滴形态异常及脂肪分化障碍,显著减轻脂肪肝和胰岛素抵抗;多部位脂肪组织缺失能够加重LDLR-KO小鼠的脂肪肝及胰岛素抵抗,脂肪组织部分去除,并未加重LDLR-KO小鼠的As。