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目的:随着人类社会的老龄化,绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)已成为影响老年妇女生活质量的一种多发病,其首要病因是绝经后雌激素水平的降低。具有骨靶向性的雌激素类药物可以在治疗PMOP的同时避开雌激素对乳腺、卵巢等非靶器官的毒副作用,因此该类药物已经称为目前抗骨质疏松药物研究的热点之一。本室以骨靶向分子大黄酸为载体,雌酚酮为母体,合成了骨靶向雌激素大黄酸哌嗪雌酚酮(rhein-piperizinyl-estrone,命名为LC),前期研究已证实LC对去卵巢大鼠具有明显的抗骨质疏松活性,并能够显著促进原代培养的大鼠成骨细胞增殖和分化。本课题进一步研究了LC对人成骨样细胞MG-63的增殖、分化功能、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)/ NF-κB激活受体配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)/ NF-κB激活受体(receptor activator of NF-κB,RANK)系统以及白介素-6(interleukin-6,IL-6)及其受体表达的作用,并对其可能的作用机制进行了初步探讨。方法:1.MTT法检测MG-63细胞的增殖能力。2.流式细胞仪检测细胞周期。3.磷酸苯二钠法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。4.逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测OPG、RANKL、IL-6及其受体(IL-6Rα、gp130)mRNA的表达水平。5.酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immnosorbent assay,ELISA)检测IL-6蛋白的表达水平。6.免疫印迹(Western Blot)技术检测OPG、RANKL、IL-6Rα及gp130蛋白的表达水平。7.采用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)分别对MG-63细胞的雌激素受体(estrogen receptor ,ER)α和ERβ基因进行沉默,G418筛选出阳性单克隆,扩大培养后用Western Blot技术分别鉴定出ERα或ERβ高、中抑制表达克隆用于研究LC对ER两种亚型的亲和力是否存在差异。8.应用荧光素酶报告基因检测法及3种有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)特异性信号阻断剂对LC作用的相关ER信号通路进行研究。结果:1. LC对人成骨样细胞MG-63生物学性能的影响LC能以剂量依赖方式显著促进人成骨样细胞MG-63增殖,并通过调控MG-63的细胞周期,使G1期细胞比例减少,G2+S期细胞比例增加进而促进细胞生长。LC通过增强MG-63细胞ALP的活性刺激成骨细胞分化成熟。LC能以剂量依赖方式显著上调MG-63细胞OPG mRNA及蛋白表达水平,显著下调RANKL mRNA和蛋白表达水平,100 nM LC的抑制作用最为显著。此外,LC尚能显著抑制MG-63细胞IL-6的转录水平和蛋白水平的表达;LC对IL-6RαmRNA的表达水平有抑制作用,而对蛋白水平的表达无作用;LC对gp130的转录水平和蛋白水平的表达均无影响。2. LC对成骨细胞作用的分子机制的研究ER阻断剂ICI182780(商品名为弗维司群,Fulvestrant)可完全阻断LC对成骨细胞的作用,表明LC经ER途径发挥作用。LC对ERα或ERβ高抑制表达细胞的作用无显著差异,提示LC对ER两种亚型的亲和力相似。LC显著增强ER基因启动子的转录活性,表明LC可通过经典的基因组作用机制即雌激素反应元件(Estrogen response element,ERE)基因转录途径发挥作用,同时MAPK特异性信号阻断剂PD98059(ERK抑制剂)、SP600125(JNK抑制剂)、SB202190(p38MAPK抑制剂)也能够部分阻断LC的作用,表明LC的作用也依赖非基因组作用机制,即MAPK信号通路。结论:1.LC能够刺激人成骨细胞增殖、分化且通过调控细胞周期进而促进成骨细胞的生长。2.LC能够促进成骨细胞OPG的表达,抑制RANKL、IL-6的表达。3.LC经ER途径对成骨细胞发挥作用且其对ER的两个亚型ERα、ERβ没有选择性。4.LC是通过激活ERE基因转录途径和MAPK信号通路对成骨细胞发挥作用的。