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单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一种胞内寄生的革兰氏阳性致病菌，能够引起动物和人类的脑膜炎、流产、败血症等疾病，死亡率能够达到20%-30%，对人类及畜牧业的生产有着重要的危害。研究证实众多的毒力因子与LM的毒力有关，其中鞭毛不仅能介导LM的运动，还在LM对细胞的黏附、侵入和繁殖过程中发挥着重要作用。作者所在实验室从发生“转圈病”的绵羊大脑中分离到1株LM，命名为LM90SB2并进行了大量相关研究，但编码鞭毛亚基的flaA基因对LM90SB2毒力及生物被膜（BF）形成的影响还未见详细报道。本研究通过利用同源重组技术构建LM90SB2的flaA基因缺失株，通过测定缺失株LM90SB2-ΔflaA的小鼠LD50测定、细胞的黏附和侵染能力以及BF的形成等的影响，分析FlaA 在LM90SB2感染过程中的作用。主要研究内容及结果如下： 1. LM90SB2的flaA基因缺失株的构建及其稳定性遗传 本实验采用重叠PCR（SOE-PCR）方法得到融合片段ΔflaA，将其与pMD19-T连接后，经过酶切再与酶切后的穿梭质粒pKSV7连接得到pKSV7-ΔflaA ，将重组质粒pKSV7-ΔflaA电转化进至LM90SB2感受态细胞中，在氯霉素与温度的压力下进行同源重组。经过30代基因重组获得双交换基因缺失株后，转入无抗性培养基最终获得无抗性的基因缺失株。试验成功构建出具有良好遗传稳定性的LM90SB2的flaA基因缺失株，并命名为LM90SB2-ΔflaA。 2. LM90SB2-ΔflaA 运动能力的测定及对小鼠毒力（LD50）的影响研究 采用半固体琼脂法测定细菌的运动性、菌落计数法计算小鼠脏器载菌量、改良寇氏法计算小鼠LD50。与野毒株相比， LM90SB2-ΔflaA的晕圈直径由1.38 cm下降到0.50 cm ，运动能力下降了63.77%；与野毒株相比LM90SB2-ΔflaA在感染小鼠肝脏中的载菌量降低，差异显著（p<0.05），脾脏与肾脏中的载菌量虽有所降低，但差异并不显著（p>0.05）；与野毒株相比，LM90SB2-ΔflaA的LD50值从4.27×106 cfu上升到了1.62×107 cfu，致病能力下降了3.8倍。结果表明FlaA显著影响LM90SB2的运动性和毒力。 3. LM90SB2-ΔflaA 黏附和侵袭MBMEC、RAW264.7细胞的能力分析 将MBMEC细胞和RAW264.7细胞培养成单层，分别按5:1和10:1的比例接种细菌。以LM90SB2为对照，分别于细菌黏附MBMEC细胞、RAW264.7细胞1 h裂解细胞，通过倍比稀释涂板进行菌落计数；细菌分别侵染上述细胞2 h后裂解细胞倍比稀释涂板后进行菌落计数。结果显示LM90SB2-ΔflaA对MBMEC细胞的黏附数（1.6×104 cfu）低于LM90SB2的黏附数（2.8×104 cfu），差异显著（p<0.05）；侵袭数（5.8×102 cfu）低于LM90SB2（6.5×102 cfu），但差异并不显著（p>0.05）。LM90SB2-ΔflaA对RAW264.7细胞的黏附数（5.0×105 cfu）和侵袭数（2.3×105 cfu）均低于LM90SB2 （8.9×105 cfu和3.3×105 cfu），差异显著（p<0.05）。试验表明FlaA能影响LM90SB2对细胞黏附和侵袭能力。 4. FlaA 对LM90SB2生物被膜形成能力的影响 将LM90SB2与LM90SB2-ΔflaA培养于96孔细胞培养板，分别于2、6、10、12 、24、48 h时用结晶紫染色，荧光倒置显微镜下观察BF形成情况；采用乙醇-丙酮混合液溶解BF，测定OD595定量测定BF的形成量；在含有盖玻片的6孔细胞培养板中培养细菌，用PI或刀豆蛋白A染色后，置于激光共聚焦显微镜下观察BF的形成情况。结果显示，光学显微镜下观察LM90SB2-ΔflaA和LM90SB2形成BF规律相似，即均在10 h左右形成较为完整的网状结构，但LM90SB2-ΔflaA整体结构松散、致密性差。在37℃时，LM90SB2-ΔflaA和LM90SB2的BF形成的OD值规律大致相同，均在10 h左右进入稳定期，但整个过程LM90SB2-ΔflaA形成BF量均偏少，差异显著（p<0.05）。25℃时，LM90SB2-ΔflaA的BF形成规律与LM90SB2大致相同，但形成过程中每个时间点LM90SB2-ΔflaA BF量下降明显，且差异极显著（p<0.01）。激光共聚焦显微镜观察结果显示LM90SB2-ΔflaA的BF结构中核酸与多糖的分布松散、稀疏、散点状分布。表明FlaA在LM90SB2的BF形成过程中起到重要的促进作用，且温度对缺失株BF的形成有明显影响。 本研究通过同源重组方法构建了flaA基因缺失株LM90SB2-ΔflaA，并研究了flaA基因缺失对LM90SB2毒力、及BF形成能力等的影响。发现与LM90SB2相比LM90SB2-ΔflaA的运动能力显著降低，对小鼠的毒力、细胞的黏附和侵袭能力、BF形成能力降低，证实flaA基因对LM90SB2的毒力及BF形成能力等起着一定的作用。