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目的:将本室构建的含梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)外膜蛋白Tp0453的优势表位(28～288aa)基因的重组表达体在E.coli M15中进行诱导表达,纯化表达产物并进行抗原性分析。应用杂交瘤技术,将SP2/0细胞与经重组蛋白Tp0453免疫的小鼠脾细胞进行融合,筛选抗重组蛋白Tp0453的单克隆抗体(mAb) ,并进行鉴定和纯化。用此mAb检测Tp感染疑似患者的分泌物标本,由此确定该mAb的应用价值,并为Tp感染诊断的研究奠定基础。方法:(1)使用镍亲和层析法纯化重组蛋白Tp0453。SDS-PAGE和Western- blot鉴定表达产物。(2)以复性后纯化的Tp0453重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。(3)体内诱生腹水法制备抗体,用硫酸铵沉淀法对腹水中的mAb进行纯化,ELISA法检测抗体效价,mAb亚类测定试剂盒鉴定mAb的类别,通过细胞涂片染色镜检计数杂交瘤细胞株染色体数目。(4)间接ELISA和间接荧光免疫试验(IIF)检测临床标本及mAb的特异性,并进行统计学分析。结果:重组目的基因表达菌在IPTG的诱导下,表达了相对分子量(Mr)约为32kDa的目的蛋白,目的蛋白在菌体细胞内主要以包涵体形式存在;经Ni-NTA亲和层析法纯化获得了纯度在95%以上的重组蛋白;Western-blot检测其能与Anti-His mAb发生特异性反应;应用纯化复性后的重组Tp0453免疫8周龄的BALB/c小鼠,经过杂交瘤技术进行细胞融合;应用ELISA法筛选出了4株分泌抗Tp0453重组蛋白mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2F8、8B9、9C6和15B2;Western-blot结果显示mAb均能与重组Tp0453很好的结合。用腹水诱生法大量制备mAb;ELISA检测4株杂交瘤细胞诱生腹水中的mAb效价分别为1:25 000、1:8 000、1:50 000和1:10 000;根据mAb亲和常数公式计算4株杂交瘤细胞分泌的mAb亲和常数分别为4.12×107M-1,2.73×108M-1,4.71×108M-1和3.64×107M-1;经Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit测定,4株杂交瘤细胞分泌的mAb,2F8为IgG2b,其它3株均为IgG1。4株mAb腹水经SDS-PAGE均显示出一条分子量约为50kDa的重链条带和一条分子量为26kDa的轻链条带。4株杂交瘤细胞染色体数在90～108范围内变化。IIF和间接ELISA对85份临床标本进行检测结果表明自制mAb能与天然抗原结合,并与镀银染色的检测结果基本符合。结论:(1)筛选出4株稳定分泌抗Tp0453 mAb的杂交瘤细胞株,经鉴定4株杂交瘤细胞分泌的mAb均能识别重组Tp0453。(2)获得的抗重组Tp0453的mAb均为IgG类抗体,且能识别Tp0453抗原的天然表位,具有较好的特异性。(3)自制mAb与镀银染色的检测结果比较具有较好的一致性,有望应用于Tp抗原的检测。