研究背景卵巢癌是女性生殖器官常见肿瘤之一,病死率几乎占妇科肿瘤之首,对妇女的生命造成严重威胁。由于卵巢癌具有起病隐匿、易转移、预后差等特点,大约3/4的患者就诊时已属晚期。手术治疗联合化疗能一定的延长患者生存期,但卵巢癌的死亡率和复发率仍然较高,五年生存率仍然较低,因此,临床上迫切需要新的能用于卵巢癌早期诊断和治疗的分子标志物,寻找新的卵巢癌相关分子是目前研究的热点和重点。目前,临床上诊断癌症主要依赖于影像,生物标志物,临床分期以及其他的一些病理学分析,细胞的生物学功能发生改变被认为是癌症发生的标志。现在人们普遍认识到蛋白质和脂类的糖基化发生改变也可以作为肿瘤发生的标志,如CA-125,Tn和Sialyl Tn,它们都是糖基化蛋白,经常作为生物学标志物来诊断癌症。其中,Tn抗原是一种肿瘤相关碳水化合物抗原,通常不在外围的组织和血细胞中表达,但是却在人类各种类型的癌细胞中表达,Tn抗原主要来源于一个正常的O-糖基化通路,即聚糖从共同的前体GalNAcα1-O-丝氨酸/苏氨酸扩展受到阻塞。该前体是在高尔基体中由一个家族多肽的产生的α-N-乙酰氨基半乳糖(ppGalNAcTs)糖蛋白,然后延伸到由单个酶称为T合酶(核心1β3半乳糖或C1GalT)组成的共同的核心O聚糖galβ1-3galnacα1-oser/苏氨酸(t抗原)。形成的t-合酶活性形式需要独特的分子伴侣称为cosmc,该cosmc(xq24在人类,xc3小鼠)在x染色体上编码。cosmc驻留在内质网(er),并防止错误折叠,聚集新合成的t-合酶,防止蛋白酶体的降解。活性的t-合酶或cosmc的表达缺失可导致tn抗原的表达,以及影响它的唾液酸化的唾液酸tn抗原在大多数肿瘤中表达。目前关于肿瘤相关性碳水化合物抗原在卵巢癌中的研究尚不多见,t-synthase,t,tn和s-tn在卵巢癌以及正常卵巢组织中的表达情况如何,它们定位于何处,以及它们与分子伴侣cosmc基因有何密切的关系,它们在肿瘤的形成过程中起着什么关键性的作用,这都有待我们通过实验来进行研究。目的1.明确t-synthase、t、tn和s-tn抗原在卵巢上皮性癌组织及正常卵巢组织中的表达及分布;2.明确t-synthase、t、tn和s-tn抗原在卵巢癌细胞系中的表达;3.明确不同表达状态下的cosmc在卵巢癌细胞中的生物学功能。方法1.收集卵巢上皮性癌组织切片和卵巢上皮性癌新鲜组织,通过免疫组织化学和westernblot的方法检测卵巢上皮性癌组织和正常卵巢组织中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的分布和表达;2.通过培养两种卵巢癌细胞系,制作细胞爬片,运用免疫细胞化学的方法检测卵巢癌细胞中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的分布和表达,同时,运用westernblot的方法检测卵巢癌细胞系中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的表达情况;3.构建cosmc过表达慢病毒载体,转染卵巢癌细胞后,通过westernblot的方法检测细胞系中t-synthase、t、tn和s-tn抗原分子表达的变化,阐明t-synthase唯一分子伴侣cosmc表达的高低对tcac表达的影响,然后,通过mtt法和流式细胞仪检测cosmc表达对卵巢癌细胞生长和凋亡的影响,运用transwell实验检测cosmc表达对卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果1.正常卵巢组织和卵巢上皮性癌组织中t-synthase、t、tn、s-tn抗原的表达。运用免疫组织化学实验对60例癌组织和20例正常组织进行t-synthase、t、tn、s-tn抗原表达的检测,实验结果发现,t-synthase主要定位于细胞质,其在卵巢上皮性癌组织中的表达较正常组织明显下调;t抗原主要定位于腺腔表面和外周细胞表面,其在卵巢上皮性癌组织中的表达较正常组织明显下降;tn抗原主要存在于胞浆内,其在卵巢上皮性癌组织中的表达较正常组织明显增高;s-tn抗原主要定位于胞浆内,在卵巢上皮性癌组织中,s-tn抗原的表达较正常组织明显上升。westernblotting实验对20例新鲜正常卵巢组织与48例卵巢上皮性癌组织样本进行t-synthase、t、tn、s-tn抗原表达的检测,实验结果表明,在卵巢上皮性癌组织中t-synthase和t抗原的表达较正常组织明显下调,而tn、s-tn的表达在卵巢上皮性癌组织中较正常组织上升明显,此结果与免疫组化结果一致。2.卵巢癌细胞系skov3和a2780中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的表达。免疫细胞化学实验对卵巢癌细胞系skov3和a2780细胞爬片中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的表达进行检测,结果表明,t-synthase、t抗原在skov3和a2780细胞中呈现低表达或不表达,而tn和s-tn抗原在skov3和a2780细胞中出现中度表达或高表达,且s-tn比tn的阳性率和敏感性更高。westernblotting检测卵巢癌细胞skov3、a2780中cosmc、t-synthase、t、tn和s-tn抗原的表达。实验结果表明,cosmc、t-synthase、t抗原表达在卵巢癌细胞中均不高,而tn和s-tn抗原在skov3、a2780细胞呈高表达,此实验结果与免疫细胞化学实验的结果一致,表明t-synthase活性的降低抑制了t抗原的表达。3.cosmc过表达对相关分子表达的影响以及其在卵巢癌细胞中的生物学功能。卵巢癌细胞a2780和skov3培养后,转染cosmc慢病毒,荧光显微镜下测转染效率,荧光强度高,转染效果在80%以上。同时,采用westernblot检测cosmc的表达,转染cosmc慢病毒的细胞组较转染空白对照的细胞,cosmc的表达量明显增加,且提高量大于2倍。通过westernblot检测cosmc过表达后,t-synthase、t、tn、s-tn抗原的表达的变化,其结果表明,过表达cosmc后,其分子伴侣t-synthase的表达显著上升,且T抗原的表达也相应增加,而相应的Tn和S-Tn抗原的表达则受到抑制,表明Cosmc可通过上调T-Synthase从而促进T抗原的形成,并抑制Tn和S-Tn抗原的表达。通过流式细胞仪检测转染Cosmc慢病毒的Skov3和A2780细胞的凋亡数。实验结果表明,Cosmc过表达的卵巢癌细胞Skov3+和A2780+的凋亡数较对照组细胞Skov3和A2780明显增加,通过MTT法检测Cosmc对卵巢癌细胞生长能力的影响,结果表明,过表达Cosmc的细胞其生长能力明显下降,此结果表明Cosmc过表达可促进卵巢癌细胞的凋亡并抑制其生长。通过分别对转染Cosmc慢病毒的Skov3+和A2780+细胞进行Transwell实验,以检测Cosmc对卵巢癌细胞侵袭能力的影响,实验结果表明,转染Cosmc的细胞穿过小室膜的数量比对照组明显减少,Cosmc过表达可抑制卵巢癌细胞的侵袭能力。结论1.T-Synthase、T抗原在卵巢上皮性癌组织中的表达较正常卵巢组织明显下降,且在卵巢癌细胞系中呈低表达或不表达;Tn和S-Tn抗原在卵巢上皮性癌组织中的表达较正常卵巢组织明显上升,且在卵巢癌细胞中呈现高表达。2.卵巢癌细胞系中过表达Cosmc基因可促进T-Synthase、T抗原的表达,且能抑制卵巢癌细胞的生长和侵袭及促进细胞凋亡。