莱姆病(Lyme disease)是由伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu lato)感染引起的主要经蜱传播的自然疫源性人兽共患病。莱姆病在全世界范围内流行,已经成为一种全球性的对人类健康造成严重危害的虫媒传染病。(1)本研究对采自8个省份的849份蜱(5属,7种)提取全基因组,基于鞭毛蛋白基因(fla)通过套式PCR(nested polymerase chain reaction)法进行伯氏疏螺旋体的检测。结果表明,不同地区的蜱体内均携带病原,平均感染阳性率为18.4%(156/849,95%CI=12.8-42.5%),在1.8%~77.4%之间。鞭毛蛋白基因序列和系统进化分析显示,有4种基因型的伯氏疏螺旋体病原:伽氏疏螺旋体(B.garinii)、狭义伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi sensu stricto)、阿氏疏螺旋体(B.afzelii)、美洲疏螺旋体(B.americana)以及一个未定种(Borrelia sp.)存在,并在我国首次报道了美洲疏螺旋体(B.americana)。(2)P66是由伯氏疏螺旋体染色体编码的外膜蛋白,分子量约为66 ku。目前的研究表明,伯氏疏螺旋体P66蛋白主要有两种功能:一是可作为一种黏附分子,结合β3整合蛋白;二是可作为外膜孔通道蛋白发挥作用。本研究根据已获得的伽氏疏螺旋体尚志株(B.garinii SZ)的全基因组数据,克隆P66基因编码的开放阅读框。结果显示,PCR扩增获得P66基因的完整ORF(1866 bp),编码621个氨基酸,分子量为68.4 ku。生物信息学分析显示,1-21氨基酸为信号肽序列,二级结构以α螺旋和β折叠为主。系统进化分析显示,伽氏疏螺旋体尚志株的P66基因与GenBank公布的伽氏疏螺旋体(美国-PBr株和德国-Pbi株)分布在同一个分支上,表明获得的P66基因是正确的。(3)以上述获得的P66基因片段为模板,设计引物并扩增获得部分P66基因。将目的片段连接表达载体pET-30a(+),转化表达菌BL21(DE3),经PCR、双酶切及测序验证正确后,进行IPTG诱导表达与纯化;将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。SDS-PAGE结果显示,获得约70 ku的表达产物。Western-blot分析表明表达产物能够与抗His标签的小鼠单克隆抗体、螺旋体感染鼠源阳性血清、兔抗P66多克隆抗体均能发生反应。抗rP66蛋白的多克隆抗体也可识别天然蛋白。(4)收集体外培养的伽氏疏螺旋体尚志株的菌液以皮下注射的方式感染BLAB/c小鼠,在感染后不同时间点收集小鼠脏器,并提取组织总RNA,获得第一链cDNA;设计针对P66基因的Real-time PCR引物,内参为鞭毛蛋白(flaB)基因,评价P66基因在宿主感染不同阶段的表达丰度。结果表明,P66基因在感染宿主后不同时间、不同组织中的表达变化规律不明显,但是脑组织中表达量的变化较为明显,间接说明P66基因与伽氏疏螺旋体的致病性相关。以上研究结果显示,通过对伽氏疏螺旋体尚志株P66基因的生物信息学分析,蛋白的克隆及原核表达,制备多克隆抗体,验证了抗体对天然蛋白的识别性,以及Real-time PCR对P66基因在宿主感染后不同阶段的表达丰度变化的评价,表明P66基因与伽氏疏螺旋体的致病性相关。