肺癌目前是世界上最常见的恶性肿瘤，严重危害人类健康。近年来，肺癌的发病率和死亡率呈急剧上升的态势。在北美，肺癌的5年生存率仅为15％，我国则更低。肺癌通常分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，在NSCLC中，肺腺癌发病率上升明显，在许多国家已超过鳞状细胞癌成为最常见的肺癌组织类型。肺癌起病非常隐匿，约3/4的患者在初诊的时候就已经发生了晚期转移，手术的机会受到了很大的限制，因此化疗仍然是肺癌进行临床治疗的重要手段之一。虽然在过去的二十之年对肺癌的生物遗传学行为的有了很大的了解，但至今仍然没有很有效的方法可以治愈肺癌。化疗耐药的存在仍然制约着肺癌治疗取得进一步效果。大多数患者的死因与耐药之间存在着直接或者间接的关系，如何逆转肿瘤细胞的耐药性将是提高肿瘤化疗效果的关键。近20年来，随着第三代化疗药物的应用，NSCLC的化学治疗有了很大进步。多西紫杉醇(docetaxel,多西他赛)是第三代化疗药物中的代表药物之一，它的前体是从欧洲紫杉针叶中提取，经半合成而获得，其作用机理主要是促进细胞内微管双聚体聚合，从而形成稳定的微管聚合物，抑制其解聚，使游离的微管数量显著减少，从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂和增殖，导致肿瘤细胞死亡，具有较高的抗肿瘤活性[3]。但与其他化疗药物一样，耐药现象的存在限制了其有效应用。有关多西他赛的实验室研究，尤其是对耐药肺腺癌细胞作用的观察及可能机制的探索，目前国内外尚少见相关报道。本课题组前期首先通过逐渐增加药物浓度在体外诱导筛选出对多西他赛耐药的肺腺癌细胞株（SPC-A1/DTX，H1299/DTX），并观察了耐药细胞与亲本细胞之间的生物学特性差异。实验结果显示，伴随肺腺癌细胞对多西他赛耐药性的增加，细胞倍增时间明显延长，侵袭转移能力增加，而凋亡率却差异不大。随后，选择经过高通量的甲基化芯片技术对亲本细胞与耐药细胞株之间基因启动子甲基化的差异谱进行筛选后确定的，与多西他赛对肺腺癌化疗敏感性相关的基因。同时，可以通过MSP的常规检测验证，这些筛选出的启动子的甲基化程度存在明显差异的基因与化疗敏感性相关。我们最终筛选出RUNX3与多西他赛化疗药物敏感性相关，并进行深入的研究。通过体外的功能实验分析了RUNX3对于诸如细胞的凋亡、增殖、细胞周期以及化疗敏感性的一系列影响。通过建立移植瘤动物模型,腹腔注射化疗药物多西他赛对小鼠进行化疗，来观测肿瘤的生长，结果表明瘤内稳定高表达RUNX3可以明显的增强化疗药物多西他赛的化疗敏感性，RUNX3与多西他赛联合化疗可以明显抑制肿瘤的生长(与单独接受多西他赛化疗而不过表达RUNX3组相比)。而体内实验结果表明通过瘤内稳定高表达RUNX3可以很明显的增强肿瘤化疗药多西他赛的化疗敏感性。以上结果可能的机制为RUNX3能够抑制AKT信号通路的激活有关。随后我们搜集了南京军区总医院肺腺癌临床组织样本进行验证，发现RUNX3高表达与患者无病生存期存在正相关关系，而与AKT1表达呈负相关。总之，肺腺癌细胞在不断接触化疗药物的情况下通过甲基化修饰来降低RUNX3的表达量以此来降低因为化疗而引起的癌细胞凋亡、周期变化等等，从而引起化疗耐药。以RUNX3作为治疗佐剂或治疗药物以增强化疗疗效的方法为肺腺癌的治疗提供了新的治疗靶点和新的思路。第一部分人肺腺癌耐多西他赛细胞株与亲本细胞株的表达与甲基化芯片差异谱测定与验证目的：探讨非小细胞肺癌耐药细胞系（SPC-A1/DTX）与亲本细胞系（SPC-A1）中发生表达差异与启动子甲基化差异的基因谱，为进一步在人类肺腺癌多西他赛耐药的人群中有关靶基因治疗的深入研究提供指导。方法：借助上海伯豪生物技术有限公司Affymetrix cDNA芯片服务平台对SPC-A1/docetaxel和亲本SPC-A1细胞进行cDNA差异表达谱进行筛选(重复三次)，经过滤条件筛选到的数据进行SAM分析，筛选出cDNA差异表达谱，并通过RT-PCR进行验证。同时依托台湾华联生物科技有限公司(Phalanx BiotechGroup)高通量DNA甲基化芯片筛选平台技术对SPC-A1/docetaxel和亲本SPC-A1细胞进行DNA甲基化差异谱进行筛选(重复三次)，经过滤条件筛选到的数据进行SAM分析，筛选出DNA甲基化差异表达谱，并通过MSP进行验证。结果：耐药细胞系（SPC-A1/DTX）中，从cDNA表达芯片数据中筛选出基因表达下降最明显的有：SERPINB5（60.9倍），LUM（57.3倍），ING4（39.4倍），CYP1A1（33.8倍），RASIP1（24.5倍），SFRP1(24.15)，RNASEK（22.1倍），TMPRSS11F（20.4倍），GALR2（18.7倍），KRT15（18.5倍），RUNX3（17.8倍），ABCG2（17.1倍），ABCC3（16.5倍）。甲基化芯片数据显示甲基化发生率（△_beta>0.8）的有FOXO1A（0.952），ADAM33（0.915），CEBPA（0.897），SFRP1（0.882），FLNC（0.873），DAPK1（0.862），SNX9（0.842），MATN2（0.831），NAP1L5（0.819），STAP2（0.816），ADAM12（0.807），HOXD11（0.806），F2R（0.804），TAPBPL（0.803），MMP14（0.802），RUNX3（0.801）。最终发现两个芯片有一个共同基因：RUNX3。经过MSP和RT-PCR验证表明RUNX3基因启动子甲基化很有可能参与了非小细胞肺癌细胞SPC-A1/DTX的多西他赛耐药。结论：与人类肺腺癌亲本细胞系（SPC-A1）相比，耐药细胞系（SPC-A1/DTX）中RUNX3基因表达明显下调，其启动子甲基化很有可能参与了非小细胞肺癌细胞SPC-A1/DTX的多西他赛耐药，有望成为肺腺癌多西他赛化疗提供有价值的分子标记物，并为逆转其耐药表型提供潜在的分子治疗靶点。第二部分RUNX3在肺腺癌中的体内与体外的功能分析目的：通过研究去甲基化药物5-Aza-dc对SPC/DTX细胞的RUNX3基因启动子甲基化状态、基因表达以及多西他赛化疗敏感性的影响。探寻RUNX3对人肺腺癌细胞化疗敏感性的调节作用，利用体内、外模型，从细胞增殖、凋亡和细胞周期等方面探讨RUNX3参与调节人肺腺癌细胞多西他赛敏感性的可能机制。方法：通过MTT法和qMSP检测不同浓度5-Aza-dc处理48小时后SPC/DTX、H1299/DTX细胞对多西他赛的IC50及RUNX3的甲基化状态及基因表达改变；通过合成RUNX3基因表达载体（N-eGFP-RUNX3）和RNA干涉载体（pGPU-shRUNX3）并分别转染人肺腺癌SPC-A1/DTX、H1299/DTX，SPC-A1、H1299细胞，人为改变细胞内RUNX3表达水平，MTT法测定细胞对多西他赛敏感性差异；克隆形成实验测定细胞体外增殖能力差异；流式细胞术检测细胞周期及凋亡率差异。将SPC-A1/DTX分别转染空质粒对照（NC-eGFP）和(RUNX3-eGFP)后建立裸鼠皮下移植瘤模型，成瘤后定时给予多西他赛腹腔注射并绘制肿瘤生长曲线，适时处死动物后取瘤体组织，免疫组化染色检测RUNX3、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）阳性率差异。结果：10uM5-Aza-dc处理SPC/DTX、H1299/DTX细胞后，其对于多西他赛的IC50值显著下降，RUNX3未甲基化比例明显升高,RUNX3表达明显升高。在SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中人为上调RUNX3表达水平后，细胞对多西他赛敏感性显著提高（p<0.01），细胞体外增殖能力下降（p<0.01），细胞早期凋亡率增加（p<0.01），细胞周期中G1显著期阻滞（p<0.01）并出现G2/M期减少（p<0.01）；相反，在SPC-A1和H1299细胞中人为下调RUNX3表达水平后，细胞对多西他赛敏感性显著降低（p<0.05），SPC-A1细胞体外增殖能力下降（p<0.05），细胞周期中G1减少（p<0.05）并出现G2/M期增加（p<0.05）。在裸鼠移植瘤模型中，人为上调RUNX3表达水平并给予多西他赛化疗可协同抑制SPC-A1/DTX细胞的成瘤能力，显著增加肿瘤细胞对多西他赛治疗的反应性，并诱导瘤体组织内PCNA表达降低，提示细胞增殖能力受阻。结论：小剂量5-Aza-dc可能通过去除RUNX3启动子甲基化状态，上调RUNX3基因表达而部分逆转SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞对多西他赛的化疗耐药。RUNX3可在体内、外对肺腺癌细胞产生显著的多西他赛化疗增敏作用，同时伴有细胞增殖受阻、凋亡增加，以及细胞周期分布的明显变化。第三部分RUNX3对下游AKT信号通路的作用及功能验证目的：进一步探讨RUNX3与下游Akt/GS3Kβ/β-catenin信号通路异常活化在人肺腺癌原发耐药中的相互作用，为研制新的抗肿瘤药物、指导临床化疗方案的选择、提高疗效和防止复发提供新的思路和理论依据。方法：将RUNX3基因表达载体（NC-eGFP）和（RUNX3-eGFP）分别转染人肺腺癌耐药细胞系（SPC-A1/DTX），使用常州楚天生物有限公司定制肿瘤表达谱PCR芯片应用实时荧光PCR同时对肿瘤信号通路相关的88个基因进行表达分析。芯片包含了与细胞周期，细胞凋亡， DNA修复，血管的形成以及肿瘤细胞转移的相关一系列基因。选定Akt/GS3Kβ/β-catenin信号通路为RUNX3下游多西他赛耐药主要相关信号通路。通过拯救实验RUNX3基因过表达载体（RUNX3-eGFP）与持续活化AKT质粒（Akt-Myr）共转染SPC-A1/DTX细胞，人为逆转RUNX3过表达对耐药细胞株的影响，Western blot检测Akt/GS3Kβ/β-catenin下游末端靶分子的蛋白表达。对人类肺腺癌亲本细胞株（SPC-A1）使用AKT抑制剂（MK-2206）, MTT法测定细胞对多西他赛敏感性差异；克隆形成实验测定细胞体外增殖能力差异；流式细胞术检测细胞周期及凋亡率差异。选取68例使用过包含多西他赛化疗方案的晚期肺腺癌患者的肿瘤组织样本，通过免疫组化检测组织中RUNX3和AKT表达情况，结合临床信息分析与临床预后的关系。结果：在人肺腺癌耐药细胞系（SPC-A1/DTX）中过表达RUNX3后，Akt1, p-AKT,p-GSK3β, β-catenin, CyclinD1, bcl-2，bcl-xl蛋白表达显著下降,而p21，Bax则显著上升。与单纯转染RUNX3过表达质粒（RUNX3-eGFP）相比，持续活化AKT质粒（Akt-Myr）共转染后，Akt1, p-AKT, p-GSK3β, β-catenin, CyclinD1,bcl-2，bcl-xl蛋白表达上升,而p21，Bax则显著下降。在人类肺腺癌亲本细胞系（SPC-A1）中通过抑制AKT信号通路，显著增加细胞对多西他赛的敏感性（p<0.01），抑制细胞增殖能力（p<0.05），有效阻滞G1期（p<0.01）并减少G2/M期（p<0.01），但细胞早期凋亡率无明显变化（p>0.05）。在肺腺癌临床组织样本中，RUNX3的表达水平与Akt1的表达（采用Spearman等级相关分析，rho=-0.625，p<0.01）存在负相关，与无病生存期（Disease Free Survival, DFS）（采用Kaplan–Meier生存曲线分析，p<0.05）。而RUNX3高表达的病人化疗敏感性高（p<0.05），而Akt1高表达的病人化疗敏感性低（p<0.05）。结论：RUNX3可以显著抑制Akt1的表达和Akt/GS3Kβ/β-catenin信号通路，拯救实验中持续活化AKT信号通路后，可以逆转RUNX3对与细胞耐药性相关的一系列重要靶分子蛋白表达的影响。在人肺腺癌亲本细胞系（SPC-A1）中抑制Akt/GS3Kβ/β-catenin信号通路后可以模拟RUNX3过表达对于人肺腺癌耐药细胞系（SPC-A1/DTX）的作用，提示RUXN3的表达下降是通过Akt/GS3Kβ/β-catenin信号通路的活化从而导致人类肺腺癌多西他赛化疗耐药。RUNX3可以作为未来逆转多西他赛化疗耐药的治疗靶点及预测靶点。