论文部分内容阅读
本试验通过体内试验和体外试验相结合的方法,探讨艾蒿醇提物（Artemisia argyi alcohol extract,AAAE）对肉仔鸡生长、免疫和抗氧化功能的影响及其作用机理。主要研究内容及结果如下:第一部分:艾蒿醇提物对肉仔鸡血清免疫和抗氧化指标的影响试验采用单因子随机区组试验设计。共选择240只1日龄爱拔益加（AA）肉仔鸡,按照初始体重相近原则随机分为5个处理组,每个处理包括6个重复,每个重复包括8只鸡。饲喂5种日粮,该5种日粮是在基础日粮的基础上分别添加0、250、500、750和1000 mg/kg的AAAE。试验分为前期（1-21 d）和后期（22-42 d）,共42d。结果表明:试验后期,日粮添加750 mg/kg的AAAE极显著提高肉仔鸡ADG,且随AAAE添加量的增加,ADFI呈极显著一次线性降低;日粮中添加适宜剂量（500-1000 mg/kg）的AAAE显著增加肉仔鸡血清中免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）、抗炎细胞因子（IL-2和IL-4）含量以及抗氧化酶（CAT和SOD）活性,并且显著降低血清促炎细胞因子（IL-1β和IL-6）及MDA含量。综合考虑,750 mg/kg的AAAE促进肉仔鸡免疫和抗氧化功能的效果更理想。第二部分:艾蒿醇提物对LPS刺激的肉仔鸡生长、免疫和抗氧化功能的影响及其机理研究试验采用2×2二因子试验设计,分别为2个日粮AAAE添加水平（0和750 mg/kg日粮）和2个LPS水平（0和750（?）g/kg体重）。共选取体重相近的192只1日龄AA肉仔鸡随机分为4个处理,每个处理6个重复,每个重复8只鸡。试验共42 d,分为预饲期（0-14 d）、应激Ⅰ期（15-21 d,LPS注射期）、恢复Ⅰ期（22-28 d）、应激Ⅱ期（29-35 d,LPS注射期）和恢复Ⅱ期（36-42 d）。处理1和处理2饲喂基础日粮,处理3和处理4饲喂试验日粮（基础日粮中添加750 mg/kg AAAE）。分别在应激Ⅰ期（试验第15、17、19、21 d）和应激Ⅱ期（试验第29、31、33、35 d）给处理1和处理3组的肉仔鸡腹腔注射750（?）g/kg体重的LPS溶液（LPS溶于生理盐水中配制成浓度为100（?）g/m L的LPS溶液）,处理2和处理4组注射等量的生理盐水。结果表明:（1）在LPS刺激期（15-21,29-35 d）,日粮中添加AAAE可显著缓解因LPS刺激导致的肉仔鸡ADG、ADFI、营养物质（DM、CP、Ca）表观代谢率、HDL-C及十二指肠VH/CD的降低,及血清ALT、LDL-C、血细胞参数（RBC、WBC、LYM、PLT）、应激激素（CORT、ACTH）的升高;（2）添加AAAE可显著缓解因LPS刺激引起的肉仔鸡肝脏IL-1β、IL-6、IgG含量和NF-κB p65、IL-1β基因表达,十二指肠IL-2含量和TLR4、IL-1β基因表达,空肠IL-6含量和My D88、NF-κB p65、IL-1β基因表达,回肠IL-1β、IL-4、IgM含量和TLR4基因表达水平以及TLR4/NF-κB信号通路中关键因子NF-κB p65和IκBα蛋白表达和磷酸化水平的升高。（3）添加AAAE显著缓解因LPS刺激导致的肉仔鸡血清CAT、SOD活性,肝脏SOD、GSH-Px活性和Nrf2、CAT、SOD、GSH-Px、HO-1基因表达,脾脏、十二指肠、空肠和回肠Nrf2、CAT、SOD、GSH-Px基因表达及回肠CAT活性的降低,并显著降低血清和组织中MDA含量。此外,AAAE增加了组织中Nrf2、HO-1和SOD蛋白表达水平,并显著降低Keap1蛋白表达水平。这些结果提示:AAAE能够增强肉仔鸡血清和组织的免疫及抗氧化能力,从而缓解LPS诱导的肉仔鸡免疫应激损伤,其作用机制可能与TLR4/NF-κB和Keap1/Nrf2通路有关。第三部分:艾蒿醇提物中黄酮的分离、纯化及其对肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫和抗氧化功能的影响通过聚酰胺-大孔树脂联用分离纯化艾蒿醇提物中的艾蒿黄酮（Artemisia argyi flavonoids,AAF）,用于外周血淋巴细胞（Peripheral blood lymphocytes,PBLs）培养试验。试验采用单因素完全随机试验设计,共设6个AAF添加水平（0、25、50、100、200、400（?）g/m L）,每个处理6个重复。结果表明:（1）添加50和100（?）g/m L AAF可显著增强淋巴细胞活力;（2）添加100和200（?）g/m L AAF显著降低细胞培养液中IL-1β含量及PBLs中IL-1β基因表达;25、200（?）g/m L和100（?）g/m L AAF剂量组分别增加了IL-2和IgG含量。另外,添加50和100（?）g/m L AAF显著降低TLR4、NF-κB p65基因表达;（3）添加100（?）g/m L AAF显著增加细胞培养液中GSH-Px、CAT、SOD活性并降低MDA含量,而且上调淋巴细胞中Nrf2、HO-1、SOD、CAT和GSHPx基因表达。综合考虑,添加100（?）g/m L AAF对淋巴细胞免疫和抗氧化作用效果最理想。第四部分:艾蒿黄酮通过TLR4/NF-κB信号通路调节肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫功能的机理研究在第三部分研究的基础上,采用单因素完全随机试验设计,以LPS诱导淋巴细胞建立免疫应激模型,利用NF-κB抑制剂（PDTC）,从NF-κB信号通路探究AAF对淋巴细胞遭受应激损伤的缓解作用。将PBLs随机分成6个处理（每个处理6个重复）,分别是:空白对照组、LPS处理组、AAF处理组、LPS+PDTC处理组、LPS+AAF处理组和LPS+AAF+PDTC处理组。结果显示:（1）LPS+PDTC和LPS+AAF处理均显著降低了培养液中IL-1β和IL-4含量,并显著增加IgG和IgM含量。（2）与LPS组相比,LPS+PDTC组和LPS+AAF组中TLR4、My D88、NF-κB p65、NF-κB p50、IL-1β和IL-6基因表达显著降低,且NF-κB p65的蛋白表达和IκBα磷酸化水平显著降低。这表明AAF对LPS诱导的细胞应激损伤的保护作用能够通过调控NF-κB信号通路下游的IL-1β基因表达来减少炎性因子的释放。第五部分:艾蒿黄酮通过Keap1/Nrf2信号通路调节肉仔鸡外周血淋巴细胞抗氧化功能的机理研究采用单因素完全随机试验设计,以LPS诱导淋巴细胞建立免疫应激模型,利用Nrf2抑制剂（ML385）,从Nrf2信号通路探究AAF对应激损伤的淋巴细胞的抗氧化作用。将PBLs随机分成6个处理（每个处理6个重复）,分别是:空白对照组、LPS处理组、AAF处理组、LPS+ML385处理组、LPS+AAF处理组和LPS+AAF+ML385处理组。结果显示:LPS+ML385和LPS+AAF处理显著增加LPS刺激的细胞培养液中GSH-Px和SOD活性,降低MDA含量。与LPS应激组相比,LPS+ML385和LPS+AAF组中Nrf2、HO-1、GSH-Px和SOD的基因表达均显著增加,并显著降低Keap1蛋白表达水平。这表明AAF能够通过调控Keap1/Nrf2信号通路的激活,来缓解LPS刺激对淋巴细胞的损伤。