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乳酸菌（Lactic Acid Bacteria,LAB）是公认的益生菌,它具有维持微生态平衡,抑制病原菌的黏附与生长,调节宿主免疫力等益生功能。乳酸菌黏附性的强弱是评估其能否成为益生菌的重要指标,是其后续发挥益生作用的前提条件。本研究对前期奶牛阴道内分离的两株生长性能良好、产酸能力较强的乳酸菌分离株进行黏附性评价,以高黏附性乳酸菌SQ0048菌株为主要研究对象,开展了SQ0048菌株黏附作用及其拮抗致病菌黏附能力的研究,并对SQ0048菌株黏附的奶牛阴道上皮细胞（Bovine Vaginal Epithelial Cells,BVECs）进行转录组学测序研究,深入探究了SQ0048菌株对BVECs中内质网蛋白质加工信号通路（Protein processing in the endoplasmic reticulum）的影响,旨在分析SQ0048菌株黏附及其拮抗致病菌的黏附能力,深入揭示SQ0048菌株发挥黏附作用及其拮抗致病菌黏附作用的分子机制。具体研究内容及结果如下:（1）SQ0048菌株的黏附作用及其拮抗致病菌黏附作用的研究采用碳氢化合物黏着法、紫外分光光度法、酶联免疫吸附法和吉姆萨染色法对两株分离乳酸菌SQ0048菌株和SQ0054菌株进行疏水特性、自凝集能力、成膜能力和黏附能力的测定;采用CCK8法和荧光标记法检测乳酸菌SQ0048菌株和致病菌对BVECs活力的影响及其黏附BVECs的量效和时效关系,并检测乳酸菌SQ0048菌株拮抗致病菌对BVECs的黏附作用以及SQ0048菌株对致病菌黏附BVECs活力的影响。疏水性结果显示,在相同p H和疏水性溶剂条件下,SQ0048菌株的疏水率均显著性高于SQ0054菌株（P<0.05）。自凝集能力结果显示,在相同p H条件下,SQ0048菌株在不同时间点的自凝集能力均显著高于SQ0054菌株（P<0.05）。成膜能力结果显示,SQ0048菌株为强被膜生物形成株,SQ0054菌株为弱被膜生物形成株,且在相同p H条件下,SQ0048菌株的成膜能力均显著高于SQ0054菌株（P<0.05）。体外黏附能力测定结果显示,SQ0048菌株对BVECs的黏附能力极显著高于SQ0054菌株（P<0.01）。乳酸菌SQ0048菌株对BVECs活力影响的结果显示,SQ0048菌株浓度为1×108CFU/m L时,不同作用时间对BVECs的活力均无显著影响（P>0.05）。SQ0048菌株黏附BVECs的量效和时效关系分析结果显示,当浓度为1×108CFU/m L,作用4 h时,SQ0048菌株黏附BVECs的荧光值达到最大,且显著高于其它作用浓度和时间点的黏附荧光值（P<0.05）。致病菌对BVECs活力影响的结果显示,与空白对照组相比,不同作用浓度和时间的大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）均可显著降低BVECs的活力（P<0.05）。致病菌黏附BVECs的量效和时效关系分析结果显示,E.coli作用浓度为1×108CFU/m L,作用3 h时,对BVECs的黏附荧光值达到最强,显著高于其它作用浓度和时间点的黏附荧光值（P<0.05）;S.aureus浓度为1×108CFU/m L,作用4 h时,对BVECs的黏附荧光值达到最强,显著高于其它作用浓度和时间点的黏附荧光值（P<0.05）。在排除试验、竞争性试验和置换试验中,乳酸菌SQ0048菌株拮抗致病菌对BVECs的黏附作用结果显示,与空白对照组相比,SQ0048菌株可显著降低E.coli和S.aureus对BVECs的黏附率（P<0.05）。SQ0048菌株对致病菌黏附BVECs活力影响的结果显示,与致病菌单独处理组的BVECs活力相比,SQ0048菌株可显著提高BVECs的活力（P<0.05）。（2）SQ0048菌株作用奶牛阴道上皮细胞的转录组学测序研究采用RNA-seq测序技术对BVECs对照组和乳酸菌SQ0048菌株作用的BVECs组进行转录组学分析,结果显示,测序共获得296个差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）,其中171个DEGs显著上调,126个DEGs显著下调。GO（Gene Ontology）富集性分析结果显示,在整个分化过程中共富集424个GO term。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集性分析结果显示,差异表达基因成功注释到171个信号通路,有23个差异显著性信号通路（P<0.05）。GO和KEGG富集性分析获得与乳酸菌SQ0048菌株免疫应答和黏附作用相关的差异显著性信号通路为抗原加工与呈递信号通路（Antigen processing and presentation）、IL-17信号通路和内质网蛋白质加工信号通路,通路共富集15个显著上调的DEGs（P<0.05）,其中,内质网蛋白质加工信号通路是富集DEGs最多的信号通路。RT-qPCR法验证15个DEGs的表达趋势与RNA-seq测序结果趋势一致。（3）SQ0048菌株黏附BVECs的分子机制研究采用RT-qPCR法和Westernblot法检测SQ0048菌株对BVECs中Sec62及HSP90AA1表达的影响;利用RNAi（RNA interference,RNAi）技术沉默Sec62基因,对Sec62沉默的BVECs进行验证,并采用RT-qPCR法和Westernblot法检测SQ0048菌株对Sec62沉默的BVECs中HSP90AA1表达的影响。利用慢病毒介导的CRISPR/CAS9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9）基因编辑技术对BVECs中HSP90AA1基因进行敲低（Knock down,KD）,采用RT-qPCR法和Westernblot法对HSP90AA1-KD BVECs进行验证,并采用CCK8法测定HSP90AA1-KD BVECs的增殖能力。采用荧光标记法检测SQ0048菌株和致病菌对HSP90AA1-KD BVECs黏附作用的影响,以及SQ0048菌株拮抗致病菌对HSP90AA1-KD BVECs黏附作用的影响。结果显示,与BVECs对照组相比,SQ0048菌株能够显著上调BVECs中Sec62和HSP90AA1基因和蛋白的表达（P<0.05）;成功筛选出可用于后续试验的干扰效率达75%的特异性沉默Sec62基因的siRNA;SQ0048菌株能够显著降低Sec62-siRNA沉默的BVECs中HSP90AA1的基因和蛋白的表达（P<0.05）,提示,SQ0048菌株上调BVECs中HSP90AA1的表达,是通过诱导Sec62的表达实现的。本研究成功构建了敲低效率达80%的HSP90AA1-KD BVECs;与SQ0048菌株黏附BVECs组相比,SQ0048菌株对HSP90AA1-KD BVECs的黏附能力显著降低（P<0.05）;与致病菌黏附BVECs组相比,致病菌对HSP90AA1-KD BVECs的黏附能力无显著影响;提示,SQ0048菌株对BVECs的黏附作用与其上调HSP90AA1的表达有关,而致病菌对BVECs的黏附作用与HSP90AA1无显著相关性（P>0.05）。与对照组相比,SQ0048菌株拮抗致病菌对HSP90AA1-KD BVECs的黏附能力显著降低（P<0.05）,提示,SQ0048菌株拮抗致病菌是通过上调HSP90AA1实现的。通过本研究主要得出以下结论:（1）乳酸菌SQ0048菌株的疏水特性、自凝集能力、成膜能力以及对BVECs的黏附力均显著或极显著高于SQ0054菌株（P<0.05）;SQ0048菌株作用浓度为1×108CFU/m L时,不同作用时间对BVECs活力均无显著性影响;SQ0048菌株可通过排除、竞争和置换方式显著降低E.coli和S.aureus对BVECs的黏附作用。（2）基于RNA-seq测序技术分析获得与SQ0048菌株发挥黏附以及拮抗致病菌黏附作用的主要信号通路为内质网蛋白质加工信号通路,其中Sec62和HSP90AA1为该信号通路中的主要相关DEGs。（3）乳酸菌SQ0048菌株黏附BVECs的分子机制与上调内质网蛋白质加工信号通路中的转运蛋白Sec62和热休克蛋白HSP90AA1的表达有关。