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苹果树腐烂病是由弱寄生子囊菌苹果黑腐皮壳（Valsa mali=V.ceratersperma（Tode:Fr.）Maire.,无性型为Cytospora sacculus（Schwein.）Gvrit.）引起的,在我国分布广、危害重,造成了巨大的经济损失,是生产上的重大灾害和重点防治对象。由于对病菌特异性侵染定殖树皮引致坏死溃烂的机理缺乏深入认识,导致高效防治技术匮乏。因此,解析该病菌与苹果互作机理成为亟待解决的关键问题。研究表明,效应基因（Effector gene）在病菌-寄主互作过程中促进病菌的侵染定殖,其与靶标的互作研究为新农药靶标位点的设计和转基因抗病育种提供了重要的材料和理论支持。所以,腐烂病菌效应基因的鉴定及其致病功能研究成为当前首要解决的问题。本研究证实了苹果树腐烂病菌含有效应基因,且发挥重要毒性功能。主要研究结果如下:1.苹果树腐烂病菌Valsa mali（Vm）效应基因的筛选鉴定:Vm全基因组含有11261个编码蛋白的完整ORF,利用生物信息学方法,根据效应蛋白含有信号肽、无跨膜结构、富含半胱氨酸、功能未知的特征,预测到候选效应基因193个,其编码蛋白平均大小为233 aa。马科夫聚类分析表明Vm没有明显的家族聚类。进而随机挑选74个候选效应基因,通过农杆菌介导的本生烟（Nicotiana benthamiana）瞬时表达体系筛选鉴定,67个候选基因不能诱导烟草细胞坏死或抑制激发子BAX诱导的烟草细胞坏死,7个基因显著抑制BAX诱导的烟草细胞坏死。通过RT-PCR技术,对7个效应基因在接菌后的0-48 h内的表达谱进行分析,发现5个效应基因不同程度上调表达,其中VM1G05336上调近30倍。在线BLAST分析发现,VM1G02400（暂定名:VmEp1）含有HeLo（PF14479）功能域,VM1G05336（暂定名:VmEp2）为Vm特有基因。结合同源克隆技术,发现VmEp1和VmEp2在Vm种内及梨腐烂Valsa pyri（V.pyri）的分离株中都有扩增,且序列上较为保守,多态性程度低,推测可能在腐烂菌侵染过程中起到重要作用。2.效应基因VmEp1和VmEp2的致病功能研究:通过Double-joint PCR技术,构建效应基因VmEp1敲除盒,结合PEG介导的原生质体转化体系,获得125个具有潮霉素抗性的转化子,随后通过PCR检测得到4个阳性转化子。利用Southern Blot杂交,发现其中两个转化子ΔVmEp1-74和ΔVm Ep1-85为该基因完全缺失突变体。在此基础上获得VmEp1回复突变体ΔVm Ep1-74#-1和ΔVmEp1-85#-1。同时,借助过表达技术得到VmEp2过表达转化子37个,通过PCR检测后获得2个过表达突变体ΔVmEp2-6和ΔVmEp2-15。菌丝生长及繁殖体发育观察结果表明,VmEp1缺失和VmEp2过表达后病菌的生长速率、菌落颜色及繁殖体产生均未观察到明显变化。用突变体和野生型分别接种苹果嫩梢和叶片测定致病力,结果显示,与野生型WT03-8相比,缺失突变体ΔVmEp1-74和ΔVm Ep1-85致病力显著降低（P<0.05）,平均下降45%,且回复突变体ΔVmEp1-74#-1和ΔVmEp1-85#-1致病力恢复到野生型水平;而过表达突变体ΔVmEp2-6和ΔVmEp2-15致病力没有明显变化（P<0.05）。说明VmEp1是病菌侵染致病的毒性因子。进而利用缺失突变方法,对VmEp1逐段缺失后瞬时表达,发现其编码氨基酸的第340-354 aa区段影响其对BAX诱导的细胞坏死的抑制,且将该段功能域回复到缺失突变体ΔVmEp1-85中后,病菌致病力回复30%。同时,亚细胞定位发现VmEp1-eGFP融合蛋白定位于烟草细胞核。3.腐烂菌-苹果互作cDNA文库的构建:利用SMART法构建了Vm-苹果嫩梢树皮均一化cDNA文库。质量评估结果显示,总容量为3.6x106 cfu,重组率为96%,插入片段大小在7502000 bp。随机挑取96个克隆,测序比对后发现,91%的片段正确且完整,且包含寄主、病菌基因片段个数比为8:1。同时,GO类功能注释发现,96个片段功能涉及14类,近200个生物学过程,主要包括基础代谢,细胞发育,植物抗病、抗逆相关的细胞组分合成、代谢等。表明文库涵盖的生物学功能齐全,且能反应腐烂病菌侵染时期寄主细胞表达信息,可以用于后续的效应基因靶标的筛选。4.靶标基因的初步鉴定及预测分析:利用构建的腐烂菌-苹果均一化cDNA文库,结合酵母双杂交技术,利用Vm Ep1作为诱饵,在四缺/X-α-Gal平板上获得30个显蓝色克隆,2次连续继代培养后,得到4个稳定的阳性克隆。通过测序及Blast分析,筛选到1个与转录因子WRKY33高度同源的基因Mwrky33（暂定名）。进而构建Prey载体pGADT7-Mwrky33,再次互作验证Mwrky33与VmEP1发生了互作。再结合RT-PCR技术,发现VmEp1缺失后,寄主Mwrky33在接种后12-36 h,尤其是24 h表达量显著降低。同时,寄主自噬（Autophagy）相关基因的表达量在接种36h,48h也显著下降。有大量研究报道转录因子WRKY33可以调控死体营养型真菌防御机制中自噬（Autophagy）相关基因的表达。可推测VmEp1与Mwrky33互作,进而影响自噬相关基因的表达来影响致病力,但仍需后续的试验证据支持。