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细胞内感染性细菌减毒后作为DNA疫苗载体是目前基因免疫研究的热点之一。沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种较为常见的侵袭性胞内菌，通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显著降低，但仍保留良好的侵袭力，可直接将真核表达质粒携带进入动物细胞内表达相应的蛋白而诱导特异性的免疫应答反应。但目前国内外还未见用减毒沙门氏菌作为载体传递禽类DNA疫苗的报道。 新城疫（Newcastle Disease, ND）是目前危害世界养禽业最严重的传染病之一。该病的病原新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）属副粘病毒科，为有囊膜的负链RNA病毒。融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）是NDV的主要宿主保护性抗原，以F基因和HN基因为免疫原研制的DNA疫苗能诱导一定程度的免疫应答，但注射免疫或基因枪免疫途径因实际操作和成本等问题难以推广应用，而直接口服重组质粒DNA免疫效果不理想。本研究探讨了利用沙门氏菌dam基因和phoP基因双突变株为载体传递NDV DNA疫苗的免疫原性和可行性。 本研究应用RT-PCR扩增了新城疫病毒强毒株F48E9株融合蛋白（F）基因，并将其插入到pcDNA3的CMV启动子下游，构建成真核表达质粒pcDNA3-F。序列测定结果表明，克隆的F基因全长1668 bp，编码553个氨基酸。序列分析和二级结构预测表明，F48E9株F蛋白含有3个分别由25个氨基酸组成的疏水区，存在6个潜在的糖基化位点，13个半胱氨酸残基，裂解位点区域的氨基酸序列为RRQRRF，说明F48E9株是一株典型的强毒株。氨基酸序列同源性比较发现，F48E9与鸡源NDV毒株的同源性在91.3%-95.5%，其中与Australia-victoria株同源性高达95.5%，而与鸽源的Ch/98-1株和鹅源的ZJ1株的同源性相对较低（90.6%）。 将真核表达质粒pcDNA3-F高压电转化dam和phoP基因双突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株（ZJ111/pcDAN3-F），并直接转染Vero细胞，分别提取细胞总DNA和总RNA，DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号。FITC标记的羊抗鸡IgG进行间接免疫荧光试验可检测到特异性的黄绿色荧光。ELISA检测结果表明，转染后48hF蛋白开始表达，随后逐渐增多。SDS-PAGE和免疫印迹可检测到55kD的蛋白条带。上述试验结果证实减毒沙门氏菌不仅可将目的基因呈递给Vero细胞，而且还得到了转录和表达，表达的F蛋白具有免疫反应性。 小鼠安全性试验表明，ZJ111/pcDNA3-F菌株只有在109cfu高剂量口服后引起个 别小鼠的死亡，其它各口服剂量组菌没有出现死亡。将ZJ帅CDAN3f以10、fu 的口服剂量口服接种3 日龄非免疫来航鸡，未见任何不良反应，也不影响鸡只的增 重，脾脏、肝脏等主要器官的沙门氏菌在二次免疫后2周己被鸡体的免疫系统所清 除，表明利用 ZJlll作为载体传递 DNA疫苗具有相对安全性。用酶切和 PCR鉴定 法证实在体内外无抗生素存在的条件下重组质粒在受体菌 ZJ 111菌株内比较稳定， 表明 ZJ 111为载体传递 DNA疫苗具有良好的稳定性。上 为了进一步探讨利用减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递NDV DNA疫苗的免疫原 性，将 ZJlll／pCDNA3F菌株分别给 3日龄非免疫鸡以 10、fu、10、fu和 10、fu的 剂量进行首兔，2周后H免，H免后4周攻击强毒株F。止。，观察其免疫原性；同时 设只含空载体pCDNA3的 ZJlll／pCDNA3菌株对照及口服 PBS对照组。结果表明： 重组 ZJlll／PCDNA3F菌株 10、fu和 10、fu免疫组均具有良好的免疫原性，对强毒 株攻击的保护率达66．7％，略高于 10、fu兔疫组K0％人 ZJll帅CDNA3F菌株的 各免疫剂量组于至二免后二周开始出现抗体，随后逐渐上升，10、fu组、10’。u组 10’。刊组至二免后第3周和第4周达到较高水平，但三者并无统计学差异（P＞0刀5）， 而且抗体产生规律也基本相似。ZJll l／pCDNA3F菌株免疫组二免后 4周诱导产生 的法氏囊 B淋巴细胞和胸腺 T淋巴细胞增殖反应显著高于 ZJlll／pCDNA3对照组 (P＜0刀5人这些结果表明ZJ 111 ／pCDNA3＊菌株10、fu为比较理想的免疫剂量， 并提示减毒沙门氏菌为载体不仅可直接将F基因呈递给鸡体细胞进行表达，而且还 能诱导产生抗NDV的体液兔疫和细胞免疫应答。 本试验还比较了减毒沙门氏菌为载体传递NDV DNA疫苗、裸质粒DNA疫苗 和弱毒疫苗的免疫效果。ZJlll／pCDAN3F 以 10bfu的剂量口服免疫，裸质粒 PCDNA3F以 200叱肌肉注射免疫，NDV 11系弱毒疫苗按常规方法滴眼和滴鼻免疫， 2周后每组各以相同的剂量和途径进行二免，二免后4周攻击致死剂量的强毒株 F。术。，观察其免疫效力。结果表明：ZJll l／pCDNA3F免疫组对强毒株的攻击保护 率为66．7％，高于pCDNA3f裸质粒肌肉注射组u0％人11系弱毒疫苗的保护率可三 达 93．3％。三种疫苗都能诱导雏鸡产生NDV抗体，ZJlll／pCDAN3F组和 pCDAN3－